4つのZIPタンパク質が、根の外側領域におけるZn、Fe、Cu、およびMnの吸収に寄与する

アラビドプシスのZip familyの遺伝子のうち、Zip2,Zip3,Zip5,Zip8の詳細な解析を行って、亜鉛や銅以外に鉄吸収に関連する遺伝子Zip2,Zip8を見出した報告である。紙面の関係上画像では、図2、図3、図5のみを紹介した。


4つのZIPタンパク質が、根の外側領域におけるZn、Fe、Cu、およびMnの吸収に寄与する

Four ZIPs contribute to Zn, Fe, Cu and Mn acquisition at the outer root domain


ケビン・ローブ1、リンカ・ルフェブル＝レジェンドル1、ファビエンヌ・クレール1、マリー・バルベロン1

ジュネーブ大学 植物科学部門、30 クアイ・エルネスト・アンセルメ、1211 ジュネーブ、スイス

bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2024.10.31.621270（未受理論文）

要約
亜鉛（Zn）は植物の成長に不可欠な微量元素であり、植物の発達に重要な役割を果たします。しかし、双子葉植物における土壌からの亜鉛吸収に関与する具体的な輸送体はまだ明確になっていません。Arabidopsis thalianaのpromoter-reporterラインを用いて、表皮で発現し、外根領域からのZn吸収に関与する可能性のあるZIP（Zn調節輸送体、鉄調節輸送体（IRT）様タンパク質）ファミリーメンバーを複数同定しました。ZIP2、ZIP3、ZIP5、およびZIP8は、表皮細胞と皮層細胞の細胞膜に主に局在し、土壌からの金属吸収における潜在的な役割を支持しています。生理学的研究、イオンプロファイリング、および遺伝学的解析を通じて、ZIP3とZIP5がZn吸収の主要な貢献者であることが判明し、一方、ZIP2とZIP8はそれぞれ銅（Cu）と鉄（Fe）の吸収に主に関与していることが明らかになりました。特に、ZIP3とZIP8は根の表皮細胞においてIRT1と同様の外側極性を示し、輸送体の極性が鉱物吸収に重要な役割を果たすことを強調しています。これらの発見は、植物根における金属吸収のメカニズムに関する新たな洞察を提供し、植物の金属含有量を向上させるためのバイオフォーティフィケーション戦略の可能性を示唆しています。

図の凡例
図1. 亜鉛欠乏が植物の成長とイオン組成に与える影響
（A） 亜鉛充足条件（+Zn）と亜鉛欠乏条件（-Zn）で3週間培養した野生型（WT）植物の代表的な画像。水平プレート（上）と垂直プレート（下）に表示。スケールバー : 1 cm。バイオリンプロットは、（B）鮮重（FW）、（C）クロロフィル含量、および（D）Fv/Fmを示す。暗順応させたWT植物を亜鉛充足条件（+Zn、青）または亜鉛欠乏条件（-Zn、オレンジ）で3週間培養した結果。ヴァイオリンプロットの破線は中央値、点線は第1四分位数と第3四分位数を表す（n≥10）。（E）茎と（F）根のイオノームプロファイル。野生型植物を亜鉛充足条件（+Zn）または亜鉛欠乏条件（-Zn）下で3週間培養した結果。データは+Zn条件を100として相対値で示され、3 独立したプールから得られた平均値に対応する。

図2. Arabidopsis thalianaの根におけるAtZIPファミリーの発現の空間的・時間的パターン 永続性。
(A) アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のAtZIPファミリー15メンバーの系統樹。この系統樹は、Phylogeny.frを使用してタンパク質配列から生成された。
(B) 制御条件下（+Zn）またはZn欠乏条件下（-Zn）で1週間培養された野生型植物の根における15のZIPメンバーの相対的転写量。結果はヒートマップで示され、制御条件（+Zn）との比較での倍増変化が強調されている。データは4つの生物学的複製から得られ、各複製は少なくとも40本の根のプールから構成されている。
(C) 異なる根の領域におけるZIP::NLS-3xmVenusの発現パターンを示す代表的な画像：領域I（根の先端、下段の画像）、領域II（早期分化領域、中段の画像）、領域III（成熟領域、上段の画像）。
核局在性のmVenusシグナルは緑色で示され、細胞壁を染色するためのPIは灰色で示されている。画像は根に沿って各ラインで同一の設定で撮影されたが、ZIP間のプロモーター活性差のため、ライン間で設定が異なった。ゾーンIでは、mVenusとPIの単一焦点画像（XY）が表示され、ゾーンIIとIIIでは、Z-スタックの最大投影（XYZ）としてmVenusシグナルが表示され、Z-スタックから抽出されたPIの単一直交ビューが重ねられている。画像はT1植物に対応する。少なくとも5つの独立したT1植物が画像化された。シグナルはT2植物でも確認された。スケールバー：すべての画像で25 μm。

図3. ZIP2、ZIP8、ZIP3およびZIP5の外根領域における局在化
(A、D、EおよびG) ZIP2、ZIP8、ZIP3またはZIP5を内在性プロモーターの制御下でmCitrineと融合させた5日齢の苗におけるmCitrine蛍光を示す代表的な共焦点画像。苗は、コントロール条件または金属欠乏条件（-Cu、-Mn、-Fe + 100 μM Ferrozine、-Zn）で培養された。上段のパネルは根の横断面画像（Zスタックから抽出）を示し、下段のパネルは根の中央焦点平面で撮影された縦断面画像を示す。対応する根の領域（図2Cで定義されたIIまたはIII）は画像の下部に示されている。すべての画像はT2植物から取得された。(A, B, D-H) mCitrineの蛍光はFireルックアップテーブル（LUT）を使用して表示されている。(B, F, H) 5日齢の苗でUBQ10::ZIP2/3/5-mCitrineを発現し、コントロール（ZIP2）または-Zn条件（ZIP3とZIP5）下で培養された植物のmCitrine蛍光シグナルの共焦点画像。根は伸長領域の表皮（Ep）細胞の中央焦点平面で画像化され、極性局在を評価した。(C) パネルB、F、H（ピンク）に示されたZIP2、ZIP3、およびZIP5-mCitrineの蛍光比分析。ZIP8-mCitrine比（オレンジ）は、根のゾーンIIIの表皮で計算された。蛍光比は、各表皮細胞の外側（Out）PMの平均蛍光強度を内側（In）PMの平均蛍光強度で割ることで決定された。この強度比は、各表皮細胞の外側（Out）PMの強度と内側（In）PMの強度に基づいて算出された。外側と内側の蛍光定量には同じ領域（ROI）が使用された。Out/In比を定量するために使用されたROIの例は、各遺伝子型（図B、D、F、H）ごとに破線四角形で示されている。比率は、各根につき少なくとも5つの細胞と、少なくとも3つの独立した根から計算された。ヴァイオリンプロットの破線は中央値を表し、点線は第1四分位数と第3四分位数を表します（n≥15）。スケールバー：すべての画像で25 μm。

図4. zip2変異体における銅の蓄積障害
(A) 制御条件下（+Cu）と銅欠乏条件下（-Cu）で10日間垂直培養した野生型（WT）と2つのzip2変異体アレルの代表的な画像。各遺伝子型から3つの代表的な植物をアガープレートに移し、画像化を行った。スケールバー：1 cm。 (B-D) +Cuまたは-Cu条件下で10日間培養した植物の(B)鮮重(FW)、(C)根長、および(D)クロロフィル含有量の分布を示すバイオリンプロット（BとCはn＞15、Dはn＞5）。ヴァイオリンプロットの破線は中央値を表し、点線は第1四分位数と第3四分位数を示す。（E）コントロールアガープレート上で3週間垂直に培養されたWTとzip2-1変異体の茎（左）と根（右）における金属含量（Fe、Cu、Mn、Zn）。各生物学的複製ごとに3〜4株をプールした（n=4）。

図5. zip8変異体における鉄の蓄積障害
(A) 制御条件下（+Fe）と鉄欠乏条件下（-Fe）で10日間垂直培養した野生型（WT）と2つのzip8変異体アレルの代表的な画像。各遺伝子型につき3株をアガープレートに移し、画像化を行った。スケールバー：1cm。 (B-D) 図Aで説明された条件下で培養された植物の(B) 鮮重、(C) 根長、および(D) クロロフィル含有量の分布を示すヴァイオリンプロット（BとCはn＞15、Dはn＞5）。ヴァイオリンプロットの破線は中央値を表し、点線は第1四分位数と第3四分位数を示します。異なる文字は、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukey'sの事後検定またはクルスカール・ウォリス検定に続いてダンンの検定（P < 0.05）により統計的に有意な差を示すことを示す。 (E) 制御条件下で3週間垂直に培養されたWTとzip8変異体の茎（左）と根（右）における金属含有量（Fe、Cu、Mn、Zn）。各生物学的複製では、3〜4株をプールした（n=4）。データは平均 ± 標準誤差で示され、茎のデータでは有意差が認められなかったため、Studentのt検定またはMann-Whitney検定で遺伝子型間の有意差を判定した。一方、根のデータは一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukeyの事後検定を実施した（P < 0.05）。


図6. ZIP3およびZIP5による亜鉛の吸収
(A) 対照条件（+Zn）および亜鉛欠乏条件（-Zn）下で10日間垂直に培養された野生型植物、zip3-1、zip5-1、および二重変異体zip3-1zip5-1の代表的な画像。各遺伝子型の代表的な3つの植物をアガープレートに移し、画像化を行った。スケールバー：1cm。 (B-D) 図Aで説明された条件下で培養された植物の(B) 鮮重、(C) 根長、および(D) クロロフィル含有量の分布を示すヴァイオリンプロット（BとCは＞15、Dはn＞5）。ヴァイオリンプロットの破線は中央値を表し、点線は第1四分位数と第3四分位数を示す。
異なる文字は、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukeyの事後検定またはKruskalーWallis検定に続いてDunnの検定により統計的に有意な差を示すことを示す（P < 0.05）。(E) WTとzip3-1zip5-1変異体の3週間培養した茎（左）と根（右）の金属含量（Fe、Cu、Mn、Zn）。各生物学的複製ごとに、3〜4株をプールした（n=4）。(F) 5日齢のWTとzip3-1zip5-1根の代表的な共焦点画像。20 μM Zinpyr-1で3時間染色した。染色前に、植物は5日間Zn欠乏条件下で培養された。上段は断面図、下段は分化した根の最大投影図を示す。スケールバー：25μm。上段のパネルは断面図を示し、下段のパネルは分化した根の最大投影図を示している。スケールバー：25μm。 (G) WTとzip3-1zip5-1根の関心領域（ROI）における内胚葉のZinpyr-1シグナルの分布を示すバイオリンプロット。少なくとも4つの独立した根が分析された（n＞15）。ヴァイオリンプロットの破線は中央値、点線は第1四分位数と第3四分位数を表します。（H）コントロールアガープレート上で3週間培養されたWT、ZIP3、ZIP5過剰発現系統の根における金属含有量（Fe、Cu、Mn、Zn）。各生物学的複製において、3〜4つのT1植物をプールした（n=4）。データは平均 ± SE で示され、異なる文字は、一元配置分散分析（ANOVA） followed by Tukeyの事後検定（P < 0.05）により統計的に有意な差を示す。(I) 5日齢のWT、35S::ZIP3（T1）および35S::ZIP5（T1）植物の代表的な共焦点画像。20 μM Zinpyr-1で3時間染色した。染色前に1 μM Znで5日間培養した。上段のパネルは分化した根の断面を示し（スケールバー：25 μm）、下段のパネルは根の先端からの最大投影を示します（スケールバー：200 μm）。

図7. ZIP3の局在化は亜鉛の可用性に依存する
(A-G) UBQ10::ZIP3-mCitrine 種子苗をZn（15 μM）を含むアガープレート上で5日間培養し、その後、Zn欠乏条件（-Zn）またはZnの10倍過剰量（10x Zn；150 μM）下で16時間液体培地に移し、画像化前に培養した。(A) UBQ10::ZIP3-mCitrineを発現する5日齢の根の代表的な最大投影画像。mCitrineシグナルは黄色で示されている。スケールバー：125 μm。 (B) 図Aに示す複数の独立した根の最大投影画像から、ZIP3-mCitrineシグナル強度を定量化した結果（n＞5）。データは平均±標準偏差で示されている。マン・ホイットニー検定（P < 0.05）により、条件間の有意な差は観察されなかった。
(C, D) パネルAに示された根の伸長領域の拡大図。画像は表皮の真ん中の焦点平面（C）と表皮の表面（D）で撮影された。mCitrineシグナルはFire（LUT）カラースケールで表示されている。スケールバー：12.5 μm。 (E) ZIP3-mCitrineシグナルの細胞膜（PM）と細胞内（intra）の比率の定量化（n＞20）。データは平均 ± 標準偏差で示され、条件間の統計的差異はマン・ホイットニー検定で決定された（*P < 0.05；**P < 0.01； ***P < 0.0001）。(F) 上記の方法で培養された植物の表皮細胞の表面像。画像化前に100 μM CHXと50 μM BFAに曝露されたもの。mCitrineシグナルはFire (LUT) カラースケールで表示されている。スケールバー：25 μm。(G) パネルFに記載の方法で処理された植物におけるZIP3-mCitrineシグナルのPM対細胞内（intra）比の定量化（n＞20）。データは平均±標準偏差で示され、条件間の統計的差異はMann-Whitney検定で決定された（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.0001）。

図2

図３

図５