Brassica napusの葉茎樹液中の遷移金属結合タンパク質と代謝物の同定と特性解析

この論文は非常に精緻な方法でアブラナの師管液を採取して、各種遷移金属と結合する相手方の低分子化合物を分析したものである。図3からFe(III)ニコチアナミン、Fe(III)クエン酸の存在が明きらかですね。

　　
Brassica napusの葉茎樹液中の遷移金属結合タンパク質と代謝物の同定と特性解析

Identification and characterization of transition metal-binding proteins and metabolites in the phloem sap of Brassica napus

Hendrik Kupper, Arun Gokul, Dario Alavez, Singha R. Dhungana, Syed Nadeem Hussain Bokhari, Marshall Keyster, and David G. Mendoza-Cozatl

J. Biol. Chem. (2024) 300(10) 107741


要旨
葉茎を介した遷移金属（TM）の分布は、植物の代謝に不可欠な部分であり、全身的なシグナル伝達とソース-シンク関係のバランスをとるために必要である。その反応性から、TMは師管内で複合体を形成すると予想される。しかし、師管中の金属種分化はほとんど未解明のままである。ここでは、アブラナ(B.napus)から師管液を単離し、サイズ排除クロマトグラフィーとセクターフィールドICP-MSをオンラインで結合させて分析した。その結果、メタロチオネイン（MT）、グルタチオン、ニコチアナミンを含む既知のTM結合タンパク質と分子が同定された。すべての金属のメインピークは低分子量（1.5 kD）であったが、Cu、Fe、S、Znを含む10〜15 kDのピークも見つかった。アフィニティタグを持つMTと持たないMTのさらなる物理化学的分析により、MTが多様な分子量の複合体を形成できることが裏付けられた。また、B. napusのMTのTM結合能力において、タグの付いたMTと付いていないMTの間に潜在するアーチファクトを同定し、その特徴を明らかにした。すなわち、ネイティブのBnMT2はZn、Cu、Feを結合するが、MT3aとMT3bはCuとZnのみを結合する。対照的に、hisタグ付きMTはCuとの結合が少なく、CoとMnと結合し、師管液と比較してより大きくオリゴマー形態に凝集することがわかった。このデータは、師管液中のTMの化学的性質は以前予想されていたよりも複雑であり、葉茎樹液中のTMおよびTM-リガンド複合体の正確な化学種分布を明らかにするためには、より系統的な解析が必要であることを示している。

分析方法に関しては一部だけ訳した
メタボロミクス
UPLCタンデム四重極型質量分析計（Xevo TQS、Waters）をポジ ティブモードで作動させ、多重反応モニタリング（MRM）によ りGSH、GSSG、ニコチアナミン（NA）を測定した（図S2）。各メソッドは、分析標準物質とGSH、GSSG、NA標準物質（5ug/ml、50％CAN、0.1％ギ酸中）を質量分析計に20ml/分の流速で直接注入して確立した。サンプル（10 ml注入）は、HSS T3（Waters）C18 カラム（1.7um、10 cm × 2.1 mm内径）を用いて、溶媒のグラジエント送液（0.4 ml/分）により分離した。溶媒A：水中0.1%ギ酸。溶媒B：アセトニトリル中0.01％ギ酸。初期条件は、0.1%Bの後、2%Bまで2分間の勾配、30%Bまで1.5分間の勾配、95%Bまで0.1分間の勾配、95%Bで1分間保持、0.1%Bまで0.1分間の勾配、0.1%Bで0.8分間保持。総実行時間は5.5分であった。カラムは45℃に加熱され、サンプルはオートサンプラーで10℃に冷却された。
MRMのトランジションは以下の通りであった： GSH（308.1>162.07；308.1>179.11）、GSSG（613.42>355.19；613.42>231.09）、NA（304.26>185.22；304.26>114.04）。


結論
本稿では、標準的な土壌条件下（すなわち、栄養豊富な条件下）で生育させたBrassica napusの師管液の分画と特性解析について報告し、師管液中の金属化学種と、hisタグが金属タンパク質に及ぼす影響に関する2つの重要な結論を示す。師管液については、我々のデータは、師管液のプロテオーム組成とメタボローム組成の点で、これまでの報告を再現したが、よく知られた低分子量と高分子量のTMリガンドの予想外の挙動も発見した。すなわち、MTは異なる分子種として師管中に見出され、GSHのような低分子リガンドはMTと共精製された。我々のデータは、師管液のユニークな環境とその組成が、MT、TM、GSHを含むこれまで知られていなかった複合体の形成に寄与している可能性を示唆している。師管は栄養配分と栄養シグナル伝達において重要な役割を担っているが、師管液の生化学はまだほとんど解明されておらず、さらなる研究が必要であることは明らかである。タンパク質のタグ付けに関しては、主な結論は、タグ付けされていないネイティブ発現が、金属タンパク質を過剰発現させるための「ゴールドスタンダード」であるべきであり、タグを使用する場合は、金属タンパク質の金属結合特性に関連するアーチファクトを防ぐために慎重に選択すべきであるということである。

　
図1.の説明
Brassica napus植物からの葉茎樹液の分離。A, ナブラの維管束組織を考慮した生殖組織付近のサンプリング（右パネル）により、さらなる分析に十分な量の樹液を得ることができた。B,採取した葉茎樹液の糖組成（左パネル）を木部樹液の糖組成（右パネル）と比較した結果、葉茎樹液の純度が高いことが確認された。データは3生物学的反復の平均±SEを表す（各生物学的反復では35株の樹液をプールした）。

図3. の説明
SEC-ICP-sfMSで、葉茎樹液と同じ条件（緩衝液、pH、流速、温度、カラム樹脂）で測定した金属リガンド化合物。したがって、図2に示したクロマトグラムと比較するのは、溶出時間ではなく、校正されたMW（右のスケール）である。

図1　B.napusの師管の採取法

図3 B.napuの師管液内での金属との結合の態様