過剰な鉄の蓄積は、デンプン合成の阻害とDNA損傷の誘発によってトウモロコシ胚乳の発達に影響を及ぼす

過剰な鉄の蓄積は、デンプン合成の阻害とDNA損傷の誘発によってトウモロコシ胚乳の発達に影響を及ぼす

Jie Zang｜Xueyan Yao｜Tengfei Zhang｜Boming Yang｜｜Zhen Zang｜Xueyan Yao｜Tengfei Zhang｜Boming Yang

J Cell Physiol. 2024;e31427.

要旨
穀物種子中の鉄（Fe）貯蔵は、ヒトの主な食事性鉄源である。トウモロコシ（Zea mays）では、種子中の鉄の蓄積は収穫量と負の相関があることが知られている。従って、高収量で穀粒中のFe濃度が高いトウモロコシ品種を開発・育種するためには、その基礎となるメカニズムを理解することが不可欠である。ここでは、試験管内での穀粒培養に成功し、培地中の過剰な鉄供給が穀粒の崩壊を引き起こし、穀粒の色が薄くなることを示した。実際、胚乳中の鉄の過剰蓄積はADP-グルコースピロホスホリラーゼ（AGPase）の存在量と活性を阻害し、ysl2変異体ではAGPaseの小サブユニットをコードするBriittle 2（Bt2）の過剰発現によって穀粒発達の欠損が緩和された。活性酸素種（ROS）と細胞死のイメージングと定量的解析から、鉄ストレスが胚乳細胞でROSバーストと深刻なDNA損傷を誘発することが示された。さらに、イーストワンハイブリッドスクリーニングにより、穀粒内の鉄ホメオスタシスに関連する候補遺伝子と、ZmYSL2を制御する上流の転写因子を同定することに成功した。これらの研究を総合すると、鉄の蓄積によって制御される種子形成の分子メカニズムに関する洞察が得られ、将来的にはトウモロコシの品種改良における鉄元素の効率的な利用が促進されるであろう。

（以下本文は3.6のみ訳す）
3.6｜穀粒内の鉄ホメオスタシスに関与する候補遺伝子の同定
穀粒内の鉄濃度が高いバイオ強化トウモロコシを開発すれば、鉄欠乏による貧血を緩和できることはよく知られている。しかし、穀粒内の高い鉄濃度はトウモロコシの収量と負の相関があった。したがって、穀粒内の鉄ホメオスタシスに寄与する遺伝資源を同定することは貴重である。我々は、文献（Gu et al., 2015; Jin et al., 2013; Qin et al., 2012; Zhang et al., 2017）から、穀粒内鉄濃度に関連する 42 の独立した量的形質座位（QTL）を収集した。各QTLのフランキングマーカーをトウモロコシゲノムの物理地図（B73 RefGen_v4）にアライメントした。そして、少なくとも2つの再現性のあるQTL局在を含む領域をホットスポット領域と定義し、穀粒Fe濃度について12のQTLホットスポットを同定した（図7a）。トウモロコシ穀粒内の鉄ホメオスタシスに寄与する未知の遺伝子を探索するため、正常および鉄過剰条件下で生育させた穀粒を用いてRNA-seqを行い、穀粒の鉄濃度に関連する現在入手可能なトランスクリプトームデータを統合して146のDEGをスクリーニングした（図7b）（Yan et al.） さらに、これらの DEGs がトウモロコシ 10 染色体上の QTL ホットスポット内に分布していることを観察し、鉄ストレスに応答するこれらの遺伝子の機能について新たな知見を得ることができた（図 7a）。
その結果、9個のDEGがホットスポット領域に位置していた（図7a、Supplementing Information S1：補足データ）。これらの遺伝子は、穀粒内の鉄の止血に寄与している可能性があり、その機能をさらに深 く調べる必要がある。
ZmYSL2は穀粒の鉄ホメオスタシスにおいて重要なトランスポーター機能である。したがって、ZmYSL2の発現を制御する転写因子の可能性を調べることは価値がある。我々は、ZmYSL2プロモーターの長さの異なる4つの断片（Pro1:-1〜-518、Pro2:-498〜-1007、Pro3： -Pro3: -1484 to -1996 bp）、pAbAiベクターにクローニングし、酵母ゲノムに組み込んだ。ライブラリーの中から、6つのbHLH転写因子を含む合計24の転写因子が選択された。興味深いことに、これらのbHLH転写因子はすべてPro2を標的としていた。そこで、Plant CAREデータベース(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)を用いてこの領域の既知のシスエレメントを検索したところ、3つのCAAT-boxモチーフ、4つのMYCモチーフ、STREモチーフ、2つのsp1モチーフの合計10個のモチーフが同定され、そのうちMYCモチーフは植物のbHLH転写因子によって認識された。その後の酵母ワンハイブリッド実験により、これら6つのbHLH転写因子がin vitroで確かにZmYSL2プロモーターのベイト配列を認識できることが確認された（図7c）。さらに、10本のトウモロコシ染色体の物理地図上で24の転写因子の分布を観察した。Zm00001d005100とZm00001d048229は、それぞれ2番染色体上の158.14-177.06Mbと9番染色体上の149.61-153.12MbのQTLホットスポットに位置していた。Zm00001d042463とZm00001d04940は、それぞれ第3染色体と第9染色体の168.69-172.88Mbと8.83-10.97MbのQTLホットスポット付近に位置していた（図7a）。総合すると、これらの転写因子はトウモロコシ穀粒内の鉄止血に関与するカジュアルな制御因子である可能性がある。



図 1 正常および鉄過剰条件下で生育したトウモロコシ近交系 B73 の穀粒の表現型的特徴。(a, b) 受粉後20日（DAP）の正常および鉄過剰条件下で生育した穀粒。 (c, d) 正常および鉄過剰条件下で生育した成熟穀粒の表現型。(e, f)受粉後20日目、通常および鉄過剰条件下で生育した穀粒の縦断面。(g, h) 20 DAPで通常および鉄過剰条件下で生育した穀粒の組織学的分析。(i, j) それぞれ(g)と(h)の拡大図。(k) 単一穀粒の粒重の分析。矢印は空洞を示す。エラーバーはSD、Studentのt検定；***p < 0.001。(a-h) scale bar, 1 mm. (i, j)スケールバー、200μm。

図2
鉄過剰蓄積は近交系B73の穀粒デンプン含量に影響を与えた。(a) 通常および鉄過剰条件下で生育した穀粒のパラフィン切片のヨウ素染色。(b) 通常および鉄過剰条件下で生育した新鮮な穀粒のヨウ素染色。(c, d) 正常および鉄過剰条件下で生育した成熟穀粒の周辺胚乳の走査型電子顕微鏡(SEM)。(e, f) 通常および鉄過剰条件下で生育した成熟穀粒の中心部の澱粉質胚乳のSEM。(g, h) (e, f)の肥大したデンプン顆粒の形態。矢印は開口部を示す。(i) 正常および鉄過剰条件下で生育した穀粒のデンプン含量。(j) プルシアンブルー染色による、通常および鉄過剰条件下で生育した穀粒の鉄分布。矢印は鉄の蓄積を示す。(k) 内胚乳中の鉄含有量の測定。(l) 胚中の鉄含有量の測定。(a,bおよびj）スケールバー、1 mm。(c-f) scale bar, 20 μm. (g,h)スケールバー、4μm。エラーバーはSD、Student's t test; **p < 0.01, **p < 0.001。PBはタンパク質本体、SGはデンプン顆粒。

図1

図2