シングルプラントオミクスが明らかにした、栄養生長から生殖成長への移行期における 転写の変化

植物の栄養成長から生殖成長への転換期には、体内代謝が激変する。古くは東京大学植物栄養肥料学研究室での大先輩である尾崎清氏らにより、止葉のアスパラギン含量が増える時期がその相転位の時期である、と栄養診断法が提唱された（1950年代）。今回の論文はそれをRNA-seqの手法で解明しようとしたものである。図の説明は複雑なので省略した。






シングルプラントオミクスが明らかにした、生長から生殖への移行期における 転写の変化

Single-plant-omics reveals the cascade of transcriptional changes during the vegetative-to-reproductive transition

Ethan J. Redmond, James Ronald, Seth J. Davis, Daphne Ezer,

The Plant Cell, 2024, 00, 1–13

要旨
植物は、生理機能の漸進的な変化と同時に、急速な発達の変遷を遂げている。さらに、個体群内の個々の植物は、非同期的に発生転換を受ける。シングルプラントオミクスは、このような二元的なプロセスと連続的なプロセスに関連する転写イベントを区別できる可能性がある。さらに、シングルプラントオミクスを用いることで、個々の植物を固有の生物学的年齢で並べ替え、高分解能の転写時系列を得ることができる。
我々は、生長から生殖への移行期にある野生型シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の葉のRNA-seqを行った。ほとんどの転写産物は、生長した植物と生長していない植物で発現が異なっていたが、いくつかの制御因子は葉のサイズやバイオマスとより密接に関連していた。擬似時間推論アルゴリズムを用いて、リボソーム生合成の減少など、いくつかの老化関連プロセスが、ボルト（抽苔）が見える前にトランスクリプトームで明らかであったことを突き止めた。このほぼ同系統の集団においても、いくつかの変異が発生形質に関連している。これらの結果は、発生の非同期性を利用することで、迅速な転写ダイナミクスを明らかにするシングルプラントオミクスの利用を支持するものである。


はじめに
植物は、葉やバイオマスの蓄積など、多くの段階的な発生変化を経験する。しかし、ある臨界点では、スイッチの役割を果たす急速な「相転移」を起こす。これらのスイッチには、幼植物から栄養成長への移行や、栄養成長から生殖成長への移行が含まれる。転写プログラムは、このような漸進的かつ二律背反的な発生過程を調整している。急速な転写の変化を理解するには、高い時間分解能のサンプル収集が必要であり、この戦略は、光や熱の開始に対する急速な転写反応を検出するために効果的に展開されてきた。しかし、この実験的アプローチは、後期発生遷移の研究には容易には適用できない。なぜなら、個々の植物は同期して発生遷移を遂げるわけではなく、その非同期の程度は、サンプリングに必要な時間分解能よりも大きいからである。この発生的非同期性は「発生的不安定性」とも呼ばれ、転写バーストなどの生化学的プロセスが本質的に確率的であるために起こる。発生非同期性は、遺伝的要因や微小環境の不均一性にも影響される。シングルプラントオミクスは、発生転換点における転写ダイナミクスを調べる画期的な方法を提供する。シングルプラントオミクスはこれまで、日中の遺伝子発現ノイズ、圃場生育集団内のトウモロコシ（Zea mays）の転写不均一性、トマトの分裂組織の不均一性を特徴づけるために用いられてきた。個体間の発育非同期性を利用することで、急速な発育転換期に起こる転写カスケードの順序を再構築することができる。我々は、被子植物における不可逆的な相転移である、植生から生殖への移行に焦点を当てている。気候変動が開花時期の同調性を低下させ、生態系や農業に影響を及ぼすことはすでに示されている。生殖成長の開始をサポートするため、この移行期には葉の中で複数のプロセスが緊密に連携している。特に重要なのは、葉の老化の開始である。これは、転写制御され、厳密に制御されたプロセスであり、葉の細胞死と生殖構造への栄養の再配分をもたらす。抽苔に伴う葉の老化は、穀物の栄養品質に重要な役割を果たす。
本論文では、シロイヌナズナ葉の抽苔開始時に発生を制御する転写カスケードを再構築するために、野生型植物集団のシングルプラントオミクスを利用した。その結果、大半の遺伝子が閂止めの時期に発現が異なり、転写状態の二元的な変化を反映していることがわかった。次に、成長に伴う転写の緩やかな変化により密接に関連する遺伝子のサブセットを同定した。これにより、リボソーム生産の停止から始まり、光合成の停止で終わる閂止めの過程で起こる一連の出来事を明らかにすることができた。われわれが推定した遺伝子ネットワークは、この重要な発生転換の根底にある転写調節経路を理解するための参考資料となる。さらに、生物学的年齢に関連する遺伝子変異を同定した。シングルプラントオミクスが、複雑な発生学的遷移の理解に役立つことを示している。

結果（一部のみ翻訳）
シロイヌナズナでは、抽苔後に広範な転写変化が起こる。抽苔は、植物体から生殖体への発育転換の指標として機能し、葉の老化の開始と葉の発育の停止と同時に起こる。 抽苔の際に生じる遺伝子発現の変化を調べるため、野生型シロイヌナズナ（A. thaliana）の個体群から、一様に制御された条件下および誘導条件下（16時間明期／8時間暗期）で生育させた個体の葉から遺伝子発現を測定した。このうち23株が抽苔した時点でサンプリングした。非同期遺伝子発現と、生長から生殖への移行期に起こる主要な発達変化との関連を調べるため、各植物から主要な発達生理学的形質を記録した。サンプル間の遺伝子発現のピアソン相関に基づいて、植物の階層的クラスタリングを行った。この解析から、サンプルは2つのクラスターに分けられることがわかった。一方のクラスターには非抽苔株が多く含まれ（45個中35個）、もう一方には抽苔株が多い（23個中18個）。そこで我々は、抽苔と同時に起こるトランスクリプトーム変化の特徴を明らかにしようとした。その結果、サンプル数が多いことを考慮し、非抽苔植物と抽苔植物との間で発現が異なる遺伝子（DEG）を見出した。全体として、3,734遺伝子が抽苔後に発現上昇し、6,967遺伝子が発現下降した。DEGに対して遺伝子オントロジー（GO）用語の濃縮解析を行った。 重要なことに、濃縮された用語は老化に関連する様々なプロセスをカバーしており、抽苔中の転写変化が老化に関連するという以前の観察と一致していた。
まず、プログラムされた細胞死は、抽苔植物で発現が上昇した遺伝子の中で多く見られた。逆に、細胞周期の制御は、ダウンレギュレートされた遺伝子の中で過剰に発現している。これらの結果は、成熟葉における細胞周期の変化と一致している。若い葉から成熟した葉では、細胞分裂から細胞伸長（エンドアデュプリケーションによってマークされる）へのシフトが起こり、老化組織では最終的にプログラムされた細胞死が起こる。
第二に、抽苔は、RNAポリメラーゼ複合体形成、RNAプロセシング、リボソームの構造構成要素など、転写と翻訳の各段階に関連する遺伝子の発現低下と相関していた。対照的に、ユビキチン化やタンパク質リン酸化といった転写後修飾に関連する遺伝子は、抽苔植物でより高発現していた。
第三に、光合成関連遺伝子の発現は、老化中のクロロフィル異化と一致して、老化植物で減少した。最後に、ジャスモン酸、アブシジン酸、サリチル酸に関連する遺伝子の過剰発現が観察された。これらのホルモンシグナル伝達経路は、以前にも葉の老化と関連していた。これらの結果は、萌芽の開始と同時に、トランスクリプトームが大規模に老化へとシフトすることを示している。

考察
シングルプラントオミクスによって、二段階発生転換と段階的発生形質に関連する遺伝子を同定することができた。シロイヌナズナ全遺伝子の半数以上が、抽苔の開始時に発現レベルが有意に変化する。生物学的複製数を増やすことで、我々のシングルプラントオミクスアプローチは、従来の研究よりも多くの異なる発現転写産物を検出することを可能にした。さらに、葉のサイズとバイオマスの蓄積を予測する転写制御因子の明確なセットを同定することができた。その中には、AGAMOUS-LIKE MADS-box転写因子ファミリーのメンバーも含まれており、そのオルソログは最近のシングルプラントオミクス研究において、ナタネの収量表現型の予測因子として注目されている。これらの結果は、シングルプラントオミクスが、発生の速い過程と遅い過程に関連する転写過程を区別するのに役立つことを示唆している。しかし、発生の遷移が速いとはいえ、このような遷移の間に起こる転写調節は、時間の経過とともに滑らかに変化する生化学的プロセスに支配されている。シングルプラントオミクスアプローチの主な利点のひとつは、最初はスイッチのように見える遷移過程における一連の変化をつなぎ合わせることができることである。われわれは、個々の植物を生物学的年齢（われわれはこれを擬似時間と呼んでいる）によって並べる新しい方法を開発した。遺伝子の独立したサブセットを利用することで、マーカー遺伝子の選択の必要性を排除し、植物の順序を一貫して特定することができた。 さらに、野生型植物の集団における遺伝的変異は、バイオマスや葉面積のような測定形質よりも仮植時間と密接に関連しているため、生物学的に意味があることを示した。擬似時間推論のための他の方法は広く使われているが、それらは数百から数千の細胞を持つシングルセルRNA-seqデータセット用に設計されているのに対し、我々の方法はより小さなサンプルサイズに有効である。ここでは、多くの老化関連プロセスが抽苔と同時進行することを示している。実際、リボソーム産生の停止など、老化に関連する初期過程のいくつかは、目に見える抽苔が始まる前に転写レベルで現れており、これは抽苔の間に起こる出来事の順序に関する先入観を覆すものである。我々は43の主要な転写制御因子を同定し、それらが栄養成長から生殖成長への移行期に発現を増減させる順序を明らかにした。その結果得られた遺伝子ネットワークは、この基本的な発生転換を支える制御を探求するための貴重なリソースとなるだろう。例えば、(i)DEGsに対する感度の向上、(ii)速い発生過程と遅い発生過程に関連する遺伝子発現変化を区別する能力、(iii)速い発生過程で起こる転写イベントのシーケンスを再構築する能力などである。擬似時間推論と組み合わせたシングルプラントオミクスは、発芽、幼植物から植物への移行、花の発生など、他の急速な発生過程の調査にも広く応用できるだろう。また、我々の研究は、ほぼ同種の実験株にも、目的とする形質に関連する遺伝的変異が残っている可能性があることを強調しており、実験は、植物個体間の不均一性を頑健に扱うように設計する必要があることを示唆している。実験室株の近同系統の複雑な集団構造については、研究コミュニティがさらに検討する必要がある。