OsHRZ1はOsVOZ2を標的としてイネのMagnaporthe oryzae感染抵抗性を負に制御する

この論文は小林高範君（現石川県立大教授）が見いだしたOsORZ1の新しい機能として、イネのいもち病菌（Magnaporthe oryzae）抵抗性との関係を見出したものである。




OsHRZ1はOsVOZ2を標的としてイネのMagnaporthe oryzae感染抵抗性を負に制御する

OsHRZ1 negatively regulates rice resistant to Magnaporthe oryzae infection by targeting OsVOZ2

Jia ying Sun ・ Zeng ran Zhou ・ Yu qi Wang ・ Dong yu Zhu ・ Dian rong Ma

Transgenic Res https://doi.org/10.1007/s11248-024-00415-8
　　
要旨
Magnaporthe oryzaeによって引き起こされるイネのいもち病は、収量を著しく減少させる。いもち病抵抗性は鉄（Fe）の状態と密接に関連しているが、イネにおける鉄の状態と免疫機能との関連については、そのメカニズムがほとんど解明されていない。今回、鉄結合性ヘメリトリンRINGユビキチンリガーゼOsHRZ1が、鉄を介したイネのいもち病抵抗性に重要な役割を果たしていることが確認された。OsHRZ1の発現はM. oryzaeの接種および高鉄処理によって抑制された。OsHRZ1の変異体はいずれもM. oryzaeに対するイネの抵抗性を増強した。OsHRZ1変異体ではOsPR1aの発現が上昇した。酵母ツーハイブリッド法、二分子蛍光相補法、Co-IPアッセイの結果、OsHRZ1は核内でVascular Plant One Zinc Finger 2 (OsVOZ2)と相互作用することが示された。さらに、試験管内ユビキチン化アッセイの結果、OsHRZ1がOsVOZ2をユビキチン化し、OsVOZ2の分解を仲介することが示された。OsVOZ2の変異体は、M. oryzaeに対する抵抗性が低下し、OsPR1aの発現が低下した。酵母ワンハイブリッド、EMSA、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、OsVOZ2はOsPR1aのプロモーターに直接結合し、その発現を活性化することが示された。まとめると、OsHRZ1は、OsVOZ2の分解を仲介することにより、イネ細胞におけるPR遺伝子の発現ダイナミクスを形成し、イネの病害抵抗性において重要な役割を果たしている。このことは、鉄シグナル伝達とイネの病原体防御の間の重要なつながりを浮き彫りにしている。

はじめに
鉄（Fe）は植物とその病原菌にとって必須の栄養素である。鉄は、増殖、脂質合成、DNA合成、呼吸、電子伝達、トリカルボン酸サイクルなど、細胞および代謝過程における酸化還元反応を制御する多くの酵素反応に不可欠な補酵素として機能する。鉄欠乏状態では、クロロフィル合成と光合成活性の低下により、クロロシスが生じ、成長が劇的に損なわれる。逆に、鉄が過剰になると、この元素はフェントン反応によって過酸化物や酸化物と容易に反応し、核酸、脂質、タンパク質を損傷する毒性の高いヒドロキシルラジカルを生成するため、有害となる。鉄の重要性を考慮し、植物や病原菌は、鉄の恒常性を維持するための様々な高度な戦略を進化させてきた。
植物が病原菌の感染に抵抗するためには、鉄ホメオスタシスの調節が不可欠である。病原体が植物組織に侵入する際、病原体は宿主植物と利用可能な鉄を奪い合わなければならない。微生物が宿主組織から鉄を獲得しようとするのに対し、植物は「鉄免疫」と呼ばれる、この元素の細胞内での利用可能性を再分配するメカニズムに取り組んでいる。このような戦略のひとつは、ディフェンシンや鉄貯蔵タンパク質を用いて局所的な鉄供給を抑制し、鉄欠乏の局所微小環境を作り出すことで、病原体の病原性、成長、増殖を阻害することである。鉄の局所的蓄積は鉄免疫のもう一つの戦略であり、感染部位に高い鉄レベルが存在すると、特にイネ科植物では、免疫防御機能に不可欠な、フェントン反応を介した大規模な活性酸素種（ROS）バーストを促進することができる。鉄欠乏に伴う植物抵抗性もまた、植物免疫の重要な一面である。
イネいもち病の原因菌であるMagnaporthe oryzaeは、世界中の栽培イネが罹患することが知られている最も壊滅的な真菌病である。イネがM. oryzaeに感染すると、感染部位にFe3+が過剰に蓄積され、宿主の活性酸素バースト活性によって病原体の増殖を著しく抑制することができる。また、高い鉄レベルはイネのM. oryzae感染に対する抵抗性を付与することができる。M. oryzae感染中、鉄で処理したイネの葉では、ジテルペン系フィトアレキシンやサクラネチンの生合成に関与する遺伝子が極めて高レベルで誘導されるなど、より強力な防御関連遺伝子の発現が明らかになった。このように鉄の状態は、イネが病原菌感染にどのように反応するかの重要な決定因子である。しかしながら、植物の鉄の状態と免疫機能との関連性の正確な分子基盤は、まだ完全に解明されていない。
Oryza sativa Haemerythrin motif-containing Really Interesting New Gene (RING)-and Zinc-finger protein 1 (OsHRZ1)は、鉄の細胞内センサーであり、根や葉の組織において鉄欠乏条件下で誘導される (Kobayashi et al. 2013)。OsHRZ1は、鉄欠乏に対応するためのいくつかの経路を制御することができ、その活性は鉄の利用可能性と密接に関連している。M. oryzae 感染は、イネ細胞内での鉄の再分布を引き起こし、この元素が感染細胞に蓄積する。本研究では、M. oryzaeの感染によって誘導される感染部位への鉄の蓄積によって、OsHRZ1の転写が抑制されることを示した。OsHRZ1はNACファミリー転写因子OsVOZ2と相互作用した。OsVOZ2はOsPR1aプロモーターに結合することで、OsPR1aの発現を正に制御していた。OsHRZ1はOsVOZ2をユビキチン化することで、イネのM. oryzaeに対する抵抗性を負に制御する。これらの結果から、OsHRZ1-OsVOZ2モジュールがM. oryzae感染時のイネにおける植物免疫と鉄ホメオスタシスをつなぐ新たなメカニズムが明らかになった。

以下図の説明です。但し紙面の都合上図1、図2、図5のみ記しておきます。

図1.
a.M. oryzae Guy11接種後のOsHRZ1の発現パターン b. 50μMデスフェリオキサミン（DFO）（-Fe）または1mM Fe-EDDHA（+Fe）処理後のOsHRZ1の発現パターン。時間は接種後数時間（hpi）。各実験は少なくとも3回行った。数値は3反復の平均値であり、エラーバーはSDを表す。黒いアスタリスクは統計的に有意な差を示す。***p<0.001

図2 イネにおけるM. oryzae抵抗性のネガティブレギュレーターとしてのOsHRZ1の機能 a OsHRZ1変異体のゲノム構造。黒枠はエクソン、線はイントロンを示す。c ZH11およびOsHRZ1変異体（-1, -2）の葉にM. oryzae Guy11を接種した。3週齢のイネ苗にM. oryzae単離株Guy11の分生胞子懸濁液を接種した。d ZH11、Oshrz1-1、Oshrz1-2葉における病変面積率 e ZH11、Oshrz1-1、Oshrz1-2葉における相対菌体量 f, g, h M. oryzae Guy11接種後のZH11、Oshrz1-1、Oshrz1-2におけるOsPR1a、OsWRKY45、PBZ1の発現。値は3反復の平均値であり、エラーバーはSDを表す。黒いアスタリスクは統計的に有意な差を示す、**p<0.01、 ***p<0.001. スケールバー： 5 mm

図3
a OsHRZ1は酵母ツーハイブリッドアッセイでOsVOZ2と相互作用する。酵母細胞の連続希釈液を、ロイシン（L）、トリプトファン（T）、ヒスチジン（H）、アデニン（A）を欠く合成ドロップアウト（SD）培地（SD-LTHA）上にプレーティングした。pGBKT7-53とpGADT7を含む酵母株を陽性対照として用い、pGBKT7-LamとpGADT7を含む酵母株を陰性対照として用いた。 b タバコにおけるOsHRZ1とOsVOZ2の相互作用のCo-IPアッセイ。入力タンパク質と免疫沈降タンパク質を、抗GFP抗体（1: 1000）または抗Myc抗体（1: 5000）を用いて検出した。 c 二分子蛍光相補性により可視化した、核におけるOsHRZ1とOsVOZ2の相互作用。OsHRZ1-nYFP、OsVOZ2-cCFP、およびH2BmCherryをタバコ葉内で共発現させた結果、H2B-mCherryとの共局在を示す機能的なYFPが形成された。スケールバー 50 μm

図5
OsVOZ2はM. oryzae感染に対するイネの抵抗性を正に制御している。 a OsVOZ2変異体のゲノム構造。黒枠と線はそれぞれエクソンとイントロンを示す。c ZH11およびOsVOZ2変異体（-1, -2）の葉にM. oryzae Guy11を接種した。3週齢のイネ苗にM. oryzae単離株Guy11の分生胞子懸濁液を接種した。d ZH11、Osvoz2-1、Osvoz2-2葉における病変面積率 e ZH11、Osvoz2-1、Osvoz2-2葉における相対菌バイオマス。値は3反復の平均値で、エラーバーはSDを表す。黒いアスタリスクは統計的に有意な差を示す、**p<0.01。スケールバー 5 mm

図1

図２

図５