アブナ科植物の師管液中の遷移金属結合タンパク質および代謝産物の同定と特性解析

ここで紹介する論文は、未受理論文であるが、公開されているので、紹介した。師管液中の高分子成分にいたる金属キレーター分析は、これまでなかったので紹介した。ニコチアナミンがばっちりと検出されているのがうれしい。


アブナ科植物の師管液中の遷移金属結合タンパク質および代謝産物の同定と特性解析

Identification and characterization of transition metal-binding proteins and metabolites in the phloem sap of Brassica napus.


要旨
師管を介した遷移金属（TM）の分布は、植物の代謝に不可欠な部分であり、全身的なシグナル伝達とソース-シンク関係のバランスをとるために必要である。その反応性から、TMは師管内で複合体として存在すると予想されるが、師管茎中の金属種分化はほとんど未解明である。ここでは、アブラナから師管樹液を単離し、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）とセクターフィールドICP-MSをオンラインで結合させて分析した。その結果、メタロチオネイン（MT）、グルタチオン、ニコチアナミンを含む、既知のTM結合タンパク質と分子が同定された。すべての金属のメインピークは低分子量（-1.5 kD）であったが、Cu、Fe、S、Znを含む追加のピーク（-10kD,
-15 kD）も見つかった。アフィニティタグを持つMTと持たないMTのさらなる物理化学的分析により、MTが多様な分子量の複合体を形成できることが裏付けられた。また、B. napusのMTのTM結合能力において、タグの付いたMTと付いていないMTの間に潜在するアーティファクトを同定し、その特徴を明らかにした。すなわち、ネイティブのBnMT2はZn、Cu、Feを結合するが、MT3aとMT3bはCuとZnのみを結合する。対照的に、hisタグ付きMTはCuとの結合が少なく、CoとMnと結合し、師管液と比較してより大きくオリゴマー形態に凝集することがわかった。このデータは、師管樹液中のTMの化学的性質は、これまで予想されていたよりも複雑であり、師管液中のTMおよびTMリガンド複合体の正確な化学種分布を明らかにするためには、より系統的な解析が必要であることを示している。

結論
本稿では、標準的な土壌条件下（すなわち、栄養豊富な条件下）で生育させたBrassica napusの師管液の分画と特性解析について報告し、師管液中の金属化学種と、金属タンパク質に対するヒスタグの効果に関する2つの重要な結論を示す。師管液については、我々のデータは、師管液のプロテオーム組成とメタボローム組成の点で、これまでの報告を再現したが、よく知られた低分子量と高分子量のTMリガンドの予想外の挙動も発見した。すなわち、MTは異なる分子種として葉茎中に見出され、GSHのような低分子リガンドはMTと共精製された。我々のデータは、師管液のユニークな環境とその組成が、MTs、TM およびGSHを含む未知の複合体の形成に寄与している可能性が示唆された。師管は栄養配分と栄養シグナル伝達において重要な役割を果たしているが、師管液の生化学的研究はまだほとんど行われておらず、さらなる研究が必要であることは明らかである。タンパク質のタグ付けに関しては、主な結論として、金属タンパク質を過剰発現させるには、タグ付けされていないネイティブ発現が「ゴールドスタンダード」であるべきである。


図4. 図4. 葉茎樹液中の遷移元素の大部分を含むフラクションにおけるグルタチオン（GSH）とニコチア ナミン（NA）の測定。図2の溶出時間105分付近のメインピークを15のフラクションに分け、(A)GSHと(NA)をメソッドセクションに記載したようにLC-MSを用いて定量した。バーは3回の独立した葉茎分画の平均±SEを表す。

図5. 精製Brassica napusメタロチオネインの酸性（pH 3、各パネル上段）および中性（pH 7、各パネル下段）条件下でのインタクト質量分析。メタロチオネインは大腸菌で過剰発現させ、アフィニティーベースの樹脂で精製し、四重極飛行時間型（QToF）質量分析計で分析した。