キュウリ（Cucumis sativus L.）の鉄欠乏応答活性化におけるNH4+のシグナル伝達機能
キュウリ（Cucumis sativus L.）の鉄欠乏応答活性化におけるNH4+のシグナル伝達機能
Fatemeh Tavakoli1 - Roghieh Hajiboland1 - Dragana Bosnic2 - Predrag Bosnic3 - Miroslav Nikolic3 - Roser Tolra4 - Charlotte Poschenrieder4
Department of Plant, Cell and Molecular Biology, University of Tabriz, Tabriz, Iran 2 Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering, University of Belgrade, Belgrade, Serbia 3 Institute for Multidisciplinary Research, University of Belgrade, Belgrade, Serbia 4 Plant Physiology Laboratory, Bioscience Faculty, Autonomous University of Barcelona, Barcelona, Spain
主な結論
NH4+ は、植物の還元型鉄欠乏反応を十分に機能させるために必要である。
要旨
窒素（N）は主に硝酸塩（NO3-）またはアンモニウム（NH4+）として土壌中に存在する。NO3-とNH4+がバランスよく供給されることが最適な生育に重要であることは一般に認められているが、鉄（Fe）獲得におけるその重要性については十分に研究されてこなかった。本研究では、水耕栽培されたキュウリ（Cucumis sativus L. cv. Maximus）に、-Fe条件下で唯一の窒素源としてNO3-を供給した。クロロシスが出現した時点で、根または葉に2 mM NH4Clを補給した。NH4+処理は、葉のSPADとHCl抽出可能Fe濃度を増加させたが、根のアポ可塑性Feは減少させた。根の一酸化窒素濃度とFROの活性が同時に増加し、エチレン作用阻害剤によってその活性が消失したことから、NH4+処理植物ではStrategy-I
の構成要素が活性化したことが示された。アンモニウムで処理した植物は、希薄可溶性の Fe(OH)3 の利用能が高く、H+、 フェノール、有機酸の根からの放出が多かった。鉄欠乏応答のマスターレギュレーター（FIT）とその下流遺伝子（AHA1、FRO2、IRT1）、およびEIN3とSTOP1の発現は、NH4+施用によって増加した。時間的解析とスプリットルートシステムの採用により、NH4+が2 mM以下の濃度で恒常的に存在することは、未知のシグナルを生成するのに十分であり、鉄欠乏症関連遺伝子の持続的なアップレギュレーションを引き起こし、その結果、鉄獲得機構が増強されることが示唆された。この結果は、NH4+が、植物の還元に基づく鉄欠乏応答において、広範囲に存在し、これまであまり認識されていなかった構成要素であることを示している。
結論
NO3ベースの培地で同時に生育させた植物に低濃度のNH4+を適用することは、低濃度のNH4+（2 mM）が、栄養的役割、H+放出効果、および／または唯一の窒素源として使用した場合のNH4+の毒性を超えたシグナル伝達機能を持つことを示している。葉と根の細胞内 NH4+ レベルは、根と葉の NH4+ 施用が分析した鉄欠乏マーカーに及ぼす影響の程度と相関していなかったことから、葉と根の NH4+ 施用によって生成され、導管と師管を移動し、鉄欠乏に対する増強された長期的な応答を保証する下流の分子が寄与していることが示唆された。そのようなシグナルの性質は不明であるが、NO/GSNO、エチレン、ポリアミン、またはH+（STOP1またはNOを介する）が有力な候補である。根と葉の施用量の違いや、経時的な解析結果から、鉄応答遺伝子の持続的なアップレギュレーションには、2 mMよりさらに低濃度のNH4+が恒常的に存在する必要があることが示唆された。本研究では、-Fe 培地中に Fe 源が存在しないため、葉の Fe 状態を有意に増加させることはできなかったが、土壌生育植物に NH4+を施用することで、根のアポプラストにおける Fe の獲得と動員、およびシュートへの輸送がかなり改善されると期待される。その結果 葉面散布の方が根面散布よりも優れた効果を示したが、これは前者が土壌成分との相互作用や微生物を介した損失なしに、生育期を通じて長期間にわたって効果を持続させることができるからである。
以下、図が多いので、わかりやすい図6と図7のみを掲載した。しかし全図の説明の翻訳は、全部しておいた。
図1
キュウリ（Cucumis sativus L. cv. Maximus）のシュート（a）と根（b）のバイオマスおよび葉の SPAD（c）。NH4+培地で鉄なし（-Fe）または十分な鉄供給（+Fe） で4日間栽培した後、CaCO3緩衝養液（2.0 mM、pH 5.8）で異なる鉄処理と同時に、根（+ NH4R）または葉（+ NH4L）を通して、鉄なし（-NH4+）および2 mM NH4+（NH4Clとして）を含む異なる NH4+レベルで2週間処理した。データは平均±SD (n=4)。異なる文字で示した棒グラフ間の差は統計的に有意である（P<0.05）。
図2
キュウリ(Cucumis sativus L. cv. Maximus)の若葉中のHCl抽出鉄(a)と全鉄(b)、根中のアポプラスティック鉄(c)と全鉄(d)の濃度。植物は、-NH4+培地で4日間Feを供給せずに生育させた後、CaCO3添加養液（2.0 mM、pH 5.8）中で-Fe処理と同時に、NH4+を根から（+ NH4R）、葉から（+ NH4L）、または未処理のまま（-NH4）で2週間処理した。データは平均±SD（n=4）。異なる文字で示した棒グラフ間の差は統計的に有意である。
図 3 -NH4+ 培地で 4 日間 Fe を供給せずに生育させた後、CaCO3 を添加した養液 (2. 0 mM) で -Fe 処理と同時に根 (+ NH4R) (d-f) または葉 (+ NH4L) (g-i) を通して、-NH4+ なし (-NH4+) (a-c) および 2 mM NH4+ (as NH4Cl) で 4 日間処理したものにおける DAF 染色を用いた一酸化窒素 (NO) の検出。 0 mM, pH 5.8）。cPTIO（NOスカベンジャー）をネガティブコントロールとして用いた（c, f, i）。露光時間はすべて同じ（20 ms）。スケールバーは200 µmを示す。
図4
キュウリ(Cucumis sativus L. cv. Maximus)の根における一酸化窒素(NO)濃度(a, c)と鉄還元酵素(FRO)活性(b, d)の経時変化。Maximus)を-NH4+培地で4日間生育させ、CaCO3添加養液(2.0 mM, pH 5.8)中で-Fe処理と同時にNH4+を根から(+ NH4R)、葉から(+ NH4L)、または無処理(-NH4)で2週間生育させた。葉面散布処理では、-NH4 植物に蒸留水を散布した。データは平均±SD（n=4）。異なる文字で示した各時点のデータ間の差は、統計的に有意である（t検定、P<0.05）。
図5
キュウリ（Cucumis sativus L. cv. Maximus）の根の一酸化窒素（NO）濃度（a） と鉄還元酵素（FRO）活性（b）の経時変化。-NH4 培地で栽培し、根（+ NH4R+および+ NH4R-）、葉（+ NH4L）、または無処理（-NH4）で、2 mM NH4（NH4Cl として）で 2 週間処理した。処理した根側を+ NH4R+、未処理の根側を+ NH4R-とした。データは平均±SD（n=4）。異なる文字で示された各時点のデータ間の差は統計的に有意である(P<0.05)
図 6
キュウリ（Cucumis sativus L. cv.Maximus）の根の鉄還元酵素（FRO）活性（a）、培地の pH（2mMのCaCO3 を添加し、毎日5.8に調整）（b）、葉の SPAD（c）。Maximus）植物（d）のSPAD（c）。-NH4+培地で4日間Feを供給せずに生育させた後、-Fe処理と同時に400μMのチオ硫酸銀（STS）の非存在下または存在下で、NH4+を根から（+ NH4R）、葉から（+ NH4L）、または未処理（-NH4）で1週間処理した。データは平均±SD（n=4）。異なる文字で示した棒グラフ間の差は統計的に有意である (t (P<0.05)
図 7
鉄欠乏（+Fe）または鉄欠乏（-Fe）条件下で栽培したキュウリ（Cucumis sativus）の-NH4培地におけるH+（a）およびフェノール化合物（b）の根からの放出率 CaCO3添加養液（2. 0mM、pH 5.8）で1週間処理した。c の下段は、CaCO3 を添加した養液で、根（+ NH4R）または葉（+ NH4L）から NH4+ を供給せず、または供給して 1 週間栽培した鉄欠乏植物を、50μM の難溶性 Fe(OH)3 を供給した -NH4 養液（pH 5.8）に 3 日間移したものである。葉のクロロフィル(a+b)とカロテノイド(Car)濃度(d)。データは平均±SD (n=4)。異なる文字で示した棒グラフ間の差は、統計的に有意である（P<0.05）。
図8
キュウリ（Cucumis sativus L.）における根の先端部（a, d, g, j）の有機酸濃度（μmol g-1 FW）と植物体全体の滲出速度（nmol g-1 FW h-1）（b, c, e, f, h, i, k, l）。 キュウリを-NH4 培地で栽培し、2 mM NH4（NH4Clとして）で根（+ NH4R）、葉（+ NH4L）、または無処理（-NH4）で処理した。滲出液は NH4 投与の 1 週間後と 2 週間後に採取・分析し、根の抽出液は 2 週間の NH4 処理後にのみ分析した。データは平均±SD (n=4)。異なる文字で示した棒グラフ間の差は統計的に有意である（P<0.05）。
図. 9
鉄欠乏（+Fe）または鉄欠乏（-Fe）条件下で栽培したキュウリ（Cucumis sativus）の根における AHA1(a, b)、FRO2(c, d)、IRT1(e, f)の-NH4 培地での相対発現（fold change）、 (NH4Cl)で 1 週間または 2 週間処理し、根(+ NH4R)または葉(+ NH4L)または無処理(-NH4)にした。データは平均±SD (n=4)。
図. 10 キュウリ（Cucumis sativus）の根を-NH4培地で鉄過剰（+Fe）または鉄欠乏（-Fe）条件下で栽培し、根（+NH4R）または葉（+NH4L）を2 mM NH4 (as NH4Cl)で1週間または2週間処理したもの、または鉄処理と同時に無処理（-NH4）にしたものにおけるEIN3 (a, b)、FIT (c, d)、STOP1 (e, f)の相対発現（倍数変化）。
データは平均±SD (n=4)。
Fig.6
Fig.7