鉄欠乏に誘導される小さなタンパク質 OLIVIAとそのbHLH 転写因子POPEYEとの関係
この論文の図3（E)には、Alphafold多量体ツールを用いた「OLV-PYEタンパク質」の相互作用の立体モデルが提示されている。このソフトを用いた論文は植物鉄栄養分野では最初の論文だと思われる。
鉄欠乏に誘導される小さなタンパク質 OLIVIAとそのbHLH 転写因子POPEYEとの関係
The small iron-deficiency-induced protein OLIVIA and its relation to the bHLH transcription factor POPEYE
Daniela M. Lichtblau1☯, Dibin BabyI, Mather Khan, Ksenia TrofimovI, Yunus Ari, Birte Schwarz, Petra Baue
1 Institute of Botany, Heinrich Heine University, Du¨sseldorf, Germany, 2 Cluster of Excellence on Plant Science (CEPLAS), Heinrich Heine University, Du¨sseldorf, Germany
PLoS ONE 19(4): e0295732. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0295732
要旨
鉄（Fe）は、多くの代謝過程で必要とされる重要な微量栄養素である。必要量と潜在的な毒性のバランスをとるため、植物は発生過程で鉄を取り込み、葉と種子に配分する量を制御している。このプロセスの重要な調節因子のひとつがPOPEYE（PYE）である。PYEは、鉄欠乏によって誘導される、植物の内部鉄の配分に重要なbHLH転写因子（TF）である。PYEが欠乏すると、鉄の移動が変化し、植物は葉のクロロシスを起こす。pye-1ではNICOTIANAMINE SYNTHASE4 (NAS4), FERRIC-REDUCTION OXIDASE3 (FRO3), ZINC-INDUCED FACILITATOR1 (ZIF1)遺伝子の発現量が高く、PYEがこれらの遺伝子を抑制していることが示された。PYEの活性は、まだ知られていない方法で制御されている。ここでは、鉄欠乏に誘導される小さなタンパク質OLIVIA（OLV）がPYEと相互作用できることを示す。OLIVIAはC末端にTGIYYと名付けたモチーフを保存している。欠失マッピングにより、OLVのTGIYYとPYEのいくつかの領域がタンパク質相互作用に関与していることを突き止めた。OLV過剰発現（OX）変異株は、NAS4遺伝子の発現亢進を示した。これは軽度の鉄欠乏応答表現型であり、PYEの機能に関連していた。olv 変異体の葉のロゼットは野生型よりも小さいままであり、OLV が植物の成長を促進することが示された。以上のことから、本研究では、鉄ホメオスタシスの側面と葉の成長制御を結びつける可能性のある候補として、小タンパク質OLVを同定した。
結論と展望
OLV は PYE の低タンパク質相互作用因子であり、鉄欠乏応答において保存されている性質が不明の TGIYY モチーフを介して相互作用する可能性がある。OLVは植物の生長とNAS4が関与する鉄欠乏応答に穏やかな影響を与えた。NAS4は鉄欠乏応答の他のTFによって特異的に標的化されることから、OLVはNAS4を制御するPYEの特定のサブ機能を制御している可能性がある。OLVは主に発芽期と、鉄欠乏によって誘導される根で発現する。今後の研究では、PYEとのタンパク質複合体形成におけるTGIYYモチーフの機能的および構造的な関連性に取り組むことができる。例えば、それぞれのプロモーターから発現させたOLVとPYEの融合タンパク質を共発現させることにより、植物の根におけるタンパク質相互作用をさらに研究することができる。
図1. PYEは酵母および植物細胞内でOLVと相互作用する。(A)OLVとPYEタンパク質の相互作用を示すレシプロ標的酵母2ハイブリッド(Y2H)アッセイ。活性化ドメイン（AD）および結合ドメイン（BD）プラスミドの組み合わせで共形質転換した酵母を、SD-LW（陽性増殖および共形質転換コントロール）およびSD-LWH + 0.5mM3-AT（タンパク質相互作用の選択）プレート上で10倍希釈系列（A600 = 10-1-10-4）でスポットした。ネガティブコントロール（NC）： BDタンパク質を添加した空のAD；空のBDを添加したADタンパク質。陽性対照（PC）： CIPK23とcAKT1 (Xu et al.,2006). (B) 一過性に形質転換したタバコ葉表皮細胞における定量的フォルスター共鳴エネルギー移動-アクセプターフォトブリーチング（FRET-APB）測定。箱ひげ図は、PYE-GFPとOLV-mCherry（mCh）のペアを用いて核内で測定したFRET効率（EFRET）と相互作用の強さを示す。NC： ドナーのみのPYE-GFP。NCと比較してFRETペアのFRET効率（EFRET）が増加していることがタンパク質相互作用の指標となる。異なる文字は統計的に有意な差を示す（one-way ANOVA and Tukey´s post-hoc test, p<0.05）。(C) 一過性に形質転換したタバコ葉表皮細胞における二分子蛍光相補（BiFC）実験。nYFP-PYEとcYFP-OLVの相互作用を示す。NC：nYFP-PYE＋cYFPbHLH39およびnYFP-ILR3＋cYFP-OLV。形質転換コントロールとしてmRFPを用いた。相補的なYFPシグナルはタンパク質相互作用を示す。矢印はYFPシグナルを示す。スケールバー：20μm。緑の矢印は正のタンパク質相互作用を示す。
図2. OLVのTGIYYモチーフはPYE-OLV相互作用に重要である可能性がある。OLVの全長（OLV-FL）と切断の模式図。アミノ酸残基の位置は番号で示されている（S1図と比較）。保存されたTGIYYモチーフは赤で描かれている。（B）一過性に形質転換したタバコの葉表皮細胞におけるcYFP-OLVトランケーションとN-YFP-PYEの相互作用を解析する二分子蛍光相補（BiFC）実験。YFPシグナルはタンパク質相互作用を示す。スケールバー：20μm。矢印は核YFPシグナルを示す。(C) 一過性に形質転換したタバコ葉表皮細胞における定量的フォルスター共鳴エネルギー移動-アクセプターフォトブリーチング（FRET-APB）測定。箱ひげ図は、PYE-GFPとOLV-mCherry（mCh）またはOLV-DT-mCのペアを用いて核内で測定したFRET効率（EFRET）と相互作用の強さを示す。NC： ドナーのみのPYE-GFP。FRET効率 NCと比較してFRETペアのFRET効率（EFRET）が増加していることは、タンパク質相互作用の指標となる。異なる文字は統計的に有意な差を示す（one-way ANOVA and Tukey´s post-hoc test, p<0.05）。(D)OLVとOLV-DTとPYEとのターゲット酵母2ハイブリッド(Y2H)アッセイ。活性化ドメイン（AD）および結合ドメイン（BD）プラスミドの組み合わせで共形質転換した酵母を10倍希釈系列でスポットした (A600=10-1-10-4）をSD-LW（陽性増殖および共形質転換コントロール）およびSD-LWH+2mM3-AT（タンパク質相互作用のための選択 プレートで行った。ネガティブコントロール（NC）： BDタンパク質を含む空のAD；空のBDを含むADタンパク質。(E) n/aは未解析。
図3. PYEの欠失マッピングから、OLV-PYEタンパク質複合体にはPYEの複数の領域が必要であることが示された。(アミノ酸残基の位置は番号で示す。保存されたbHLHドメインとEARモチーフはシアン色と紫色で描かれている。(B）PYE-FL、PYEトランケーションとOLV間のターゲット酵母2ハイブリッド（Y2H）アッセイ。活性化ドメイン（AD）および結合ドメイン（BD）プラスミドの組み合わせで共形質転換した酵母を、SD-LW（陽性増殖および共形質転換コントロール）およびSD-LWH + 2 mM3-AT（タンパク質相互作用の選択）プレート上で10倍希釈系列（A600 = 10-1-10-4）でスポットした： BDタンパク質を含む空のAD；空のBDを含むADタンパク質。C) 一過性に形質転換したタバコ葉表皮細胞における定量的フォルスター共鳴エネルギー移動-アクセプターホトブリーチング（FRET-APB）測定。ボックスプロットは、OLV-GFPとPYE-mCherry（mCh）のペア、または指示されたPYE変異体-mChを用いて核内で測定したFRET効率（EFRET）と相互作用の強さを示す。 NC：ドナーのみのOLV-GFP。NCと比較してFRETペアのFRET効率（EFRET）が増加していることは、タンパク質相互作用の指標である。異なる文字は統計的に有意な差を示す（one-way ANOVA and Tukey´s post-hoc test, p<0.05）。(D) B, Cのタンパク質相互作用のまとめ。(E）Alphafold多量体ツール（Evans et al., 2021）を用いたOLV-PYEタンパク質の予測構造。カラーコードは調査したタンパク質ドメインを示す。拡大図は枠で囲んだ。
図1
図2
図3