OsNAS2のシス制御エレメントのCRISPRによるプロモーター編集はイネにおけるZnの取り込み/トランスロケーションと植物収量を増加させる

この論文は、植物のゲノム編集イネをフィールドで検定した先駆的な研究である。ここで用いているOsNAS2遺伝子は、そもそも最初に、Kyoko Higuchi さんが東大にポスドクでいたころに世界で最初に発見し、以下の論文で発表したものである。この最重要論文が引用されていないのは、ちょっと情けない。refereeによるチェックが甘いと思う。

Cloning of Nicotianamine Synthase Genes, Novel Genes Involved in the Biosynthesis of Phytosiderophores
Kyoko Higuchi, Kazuya Suzuki, Hiromi Nakanishi, Hirotaka Yamaguchi, Naoko-Kishi Nishizawa, Satoshi Mori Author Notes
Plant Physiology, Volume 119, Issue 2, February 1999, Pages 471–480
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OsNAS2のシス制御エレメントのCRISPRによるプロモーター編集はイネにおけるZnの取り込み/トランスロケーションと植物収量を増加させる

CRISPR-mediated promoter editing of a cis-regulatory element of OsNAS2 increases Zn uptake/translocation and plant yield in rice
　
Yvonne Ludwig1、Conrado Dueñas Jr.2、Erwin Arcillas1、
Reena Jesusa Macalalad-Cabral1、Ajay Kohli1、Russell Reinke1、および イネス・H・スラメット＝ローディン1*1
　
1国際稲研究所、イネ育種イノベーションズ、イネ遺伝設計・検証ユニット Innovations, Los Baños, Philippines、2Department of Biology and Biotechnology "L. Spallanzani"、 イタリア、パヴィア、パヴィア大学
　
Front. Genome Ed. 5:1308228.
doi: 10.3389/fgeed.2023.1308228

　　　
要旨
高収量で栄養価の高いコメを開発することは、開発途上国における微量栄養素の欠乏、特に亜鉛と鉄（Fe）の欠乏を伴う人間の栄養失調の問題を軽減し、より良い普及を達成するためのアプローチの一つである。鉄や亜鉛などの微量栄養素の輸送は、主にニコチアナミン合成酵素（OsNAS）遺伝子ファミリーを介して制御されているが、収量は複数の遺伝子座が関与する複雑な形質である。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9を用いたゲノム編集では、OsNAS2プロモーター、特に-933位のシス制御エレメントARR1ATの欠失に着目し、穀粒中および植物体あたりのZnの蓄積を高めることを目指した。その結果、われわれのプロモーター編集により、一株当たりのZn濃度が増加することが示された。また、主穂あたりの小穂数の向上により、一株あたりの穀粒が増加することも示された。この形質は、「トランスジーンフリー」およびホモ接合体の植物子孫に遺伝した。圃場条件下での形質発現を検証し、穂数増加の原因を解明するためには、さらなる調査が必要である。
　
緒言
簡単な食事でも空腹を満たすことはできるが、"隠れた飢餓 "を克服できるのは、栄養価の高い豊かな食事だけだ。栄養不足はアフリカ、南アジア、ラテンアメリカで多く見られ、世界で約30億人に影響を与えている（Kumar et al.） 広く見られる栄養不良は、鉄欠乏性貧血、亜鉛欠乏症、ビタミンA欠乏症であり、知的・身体的成長を阻害したり、免疫系の反応を低下させたりするなど、人体に深刻かつ長期にわたる影響を及ぼす（Majumder et al.） 妊娠中、栄養失調の食事は低出生体重児を出産するリスクを高めるため、胎児の成長に影響を与え、乳児の生存さえ危うくする（Kumar et al.） 微量栄養素は、植物の代謝と恒常性維持において様々な重要な役割を果たしている。必須微量栄養素のひとつに亜鉛（Zn）があり、補酵素としての働き、ヌクレオチドの合成、酵素や植物成長ホルモン（オーキシンなど）の活性化など、植物の数多くの機能や生化学的プロセスに関与している。同様に、Znは遺伝子発現やタンパク質、脂質、核酸の合成など、植物の成長や代謝プロセスに関与する（Zaman et al.） 鉄（Fe）もまた、植物の生理学的・生化学的経路において重要な役割を果たす重要な微量栄養素である。シトクロムなど様々な酵素の構成成分であり、葉緑体の構造と機能の維持、クロロフィルの合成と呼吸に関与している（Rout and Sahoo, 2015）。しかし、米、トウモロコシ、小麦などの主食のほとんどは、もともと微量栄養素の含有量が低く、1日の必要量を満たすことができない。そのため、作物、特に米の栄養価を高めることが、ますます大きな課題となっている。約35億人がコメを消費しているが、コメは大規模な穀物加工（精米、蒸し、パーボイリング）を行うため、消費前にかなりの量の微量栄養素が失われる（Prom-u-thai et al.） 推定平均所要量（EAR）の30％を満たすためには、精白米の栄養品質を、ベースライン（Feは2ppm、Znは16ppm）からZnは12ppm、Feは11ppm向上させる必要がある（Van Der Straeten et al.） 従来の育種ではZnとFeの含有量を高めたイネの自然変異が限られているため、遺伝子工学は微量栄養素の含有量を高めたイネを作出するのに役立つツールである。トランスジェニック・アプローチは、主に鉄と亜鉛のトランスロケーション、貯蔵、取り込みの主要遺伝子をターゲットとしている。単一または複数の遺伝子の過剰発現やサイレンシングなど、さまざまな戦略によって、穀物中の鉄と亜鉛の濃度を高めることに成功した。イネでOsNAS2遺伝子を過剰発現させたり（Johnsonら、2011年）、遺伝子（OsNAS2とHvNAAT）を組み合わせたりすることで微量栄養素濃度が上昇することを報告した研究があり、最大55μg/gのFe濃度の上昇が明らかになった（Diaz-Benitoら、2018年）。Trijatmikoら（2016）は、圃場条件下で生育させた遺伝子組換え植物からの精白米において、最大15μg/gのFeと45.7μg/gのZnという有望な結果を報告した。Wuら（2019）は、AtNRAMP3、AtNAS1、およびPvFerカセットを発現するトランスジェニックイネ系統を作出し、玄米で48.18μg/g Znおよび13.65μg/g Feに達した。研究の大半は、取り込み、転流、貯蔵を強化するために、イネゲノムに同種または異種の遺伝物質を挿入することにより、Zn/Fe濃度を増加させたことを報告している（Ludwig and Slamet-Loedin, 2019）。イネ バイオフォーティフィケーションの今後の戦略では、遺伝子編集の標準的なツールとなったCRISPRシステムが使用されるだろう。重要な側面の1つは、所望の形質改良を施した「遺伝子導入のない」植物を迅速に生成できる可能性である。
多くの農業形質は、株高、小柱長、種子長、生育期間など間接的に、あるいは株あたりの小柱数、株あたりの小柱数、1000粒重など直接的に収量に関係している（Li et al.） CRISPR-Cas9を用いて、イネの収量を向上させる試みがいくつかなされてきた。標的遺伝子は、Gn1a（粒数1a）、DEP1（密で直立したパニクル1）、GS3（粒径3）、IPA1（理想的な植物構造1）であった。T2世代の突然変異解析から、粒数の増加、密な直立パニクル、粒径の拡大が明らかになった（Li et al.） 他の研究では、OsGS3、OsGW2、およびOsGn1aを多重ゲノム編集アプローチに関与させ、トリプレット変異体と、1パニクルあたりの収量が30％〜68％増加した（Zhou et al.） さらに、アブシジン酸（ABA）やサイトカイニン（CK）など、植物の成長・発達やストレス応答に関わる植物ホルモンが収量に関係することが知られている。ABA受容体であるピラバクチン抵抗性1様体（PYL1）、PYL4、PYL6をゲノム編集法を用いて標的とした結果、圃場条件下で野生型と比較して最大31％増の穀粒が得られた（Miao et al.） イネのサイトカイニン活性化酵素様遺伝子を標的とするOsLOG5を変異させた編集植物は、対照植物よりも有意に高い数の種子形質（種子結実率、全粒数、1粒/1パニクルあたりの粒数、1000粒重の増加）を示す（Wang et al.）。OsNAS2および他のZnトランスポーターおよび吸収遺伝子は、B型OsRRを介するシグナル伝達経路を介して制御されることが知られている（Gao et al.）。 OsRRのARR1ATモチーフとして知られる結合部位が破壊される可能性があると、Znの取り込みおよび／または移動に対する抑制効果が低下し、作物植物および／または穀物内のZn濃度が上昇する可能性がある。Zn濃度はサイトカイニン濃度と相関している（Gao et al.）。 本研究では、イネのエリート品種IR64において、ゲノム編集ツールCRISPRを用いて導入されたOsNAS2プロモーター配列の改変について研究した。ARR1ATモチーフを標的とする3つのIR64-CRISPR系統を数世代にわたって解析し、Z1ATモチーフの増加に基づいて候補株を選抜した。イネ穀粒中のZnおよびFe濃度の増加、ヌクレアーゼおよびバイオマーカーの非存在、ホモ接合体変異の可能性に基づいて候補植物が選択された。その結果、T3「トランスジーンフリー」植物とホモ接合体植物が収量関連形質と微量栄養素濃度について分析された。




図1。
エリートイネIR64におけるOsNAS2のプロモーター構造と、イネ穀粒中のZn濃度を高めると推定されるメカニズム：（A）1kbのプロモーター領域内のCRE ARR1AT（緑）とGTGANTG10（赤）の1kbプロモーター領域内の同定。(B）OsNAS2プロモーター領域のARR1ATモチーフを破壊した後の種子数と分枝に対するポジティブな効果の仮説ネットワーク。CK、サイトカイニン；OsRR、Oryza sativa spp.応答制御因子。

図3
組織培養対照（TC）と比較した T1 種子の Zn および Fe 濃度：各候補株および対照株の玄米種子 150 個を XRF で測定した。各サンプルは2回測定した。標準誤差は各サンプルの測定値の差を示す。

図5
IR64野生型対照と比較した、選択したT4候補の植物あたりの推定ZnおよびFe濃度： ZnおよびFe濃度は蛍光X線分析により測定し、植物体当たりのZnおよびFe濃度の合計は、植物体の総収量に基づいて計算した。

図1

図3

図5