イネにおけるマンガン、銅および亜鉛トランスポーターの制御におけるOsbHLH156-OsIRO2転写因子複合体の役割
この論文はFe欠乏下でのZn,Mn,Cuのクロストークの遺伝子発現版である。紙面の都合上図は、Fig.1, Fig.4, Fig.5のみを掲載した。個人的に興味が湧いたので、実験方法以外全訳した。受理されているが未発刊論文である。
イネにおけるマンガン、銅および亜鉛トランスポーターの制御におけるOsbHLH156-OsIRO2転写因子複合体の役割
Role of OsbHLH156-OsIRO2 transcription factor complex in regulating manganese, copper and zinc transporters in rice
Jiamei Zhu, Jie Li, Xiaoying Hu, Jin Wang, Jing Fang, Shoudong Wang, Huixia Shou
State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China
Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130102, China
受理だが未掲載論文(多分J.exp.Bot)
（要旨）
鉄(Fe)、マンガン(Mn)、銅(Cu)、亜鉛(Zn)は、植物の成長と発育に必要な必須微量栄養素であるが、最適レベルを超えると毒性を示すことがある。植物は、これらの金属の取り込み、輸送、貯蔵を含む複雑なホメオスタシスネットワークを進化させてきた。鉄欠乏条件下では、転写因子（TF）複合体 OsbHLH156/OsIRO2 が活性化され、Strategy II の鉄獲得に関する中心的な制御因子として働くことが示された。本研究では、Mn、CuおよびZnの吸収におけるTF複合体の役割を評価した。鉄欠乏はシュートの Mn、Cu、Zn 濃度を有意に上昇させたが、osbhlh156 と osiro2 変異体ではこれらの二価金属濃度の上昇が有意に抑制されたことから、TF 複合体が Mn、Cu、Zn の取り込みと輸送に関与していることが示唆された。RNAシークエンシングアッセイにより、osbhlh156およびosiro2変異体では、Mn、Cu、Znの取り込みと輸送に関連する遺伝子が有意に抑制されていることが示された。転写活性化アッセイにより、TF複合体はOsIRT1、OsYSL15、OsNRAMP6、OsHMA2、OsCOPT1/7、OsZIP5/9/10のプロモーターに直接結合し、それらの発現を活性化できることが示された。さらに、TF複合体はニコチアナミン（NA）と2'デオキシムギニン酸（DMA）合成遺伝子の発現を活性化するのに必要であり、これらはMn、Cu、Znの取り込みと輸送を促進する。さらに、OsbHLH156とOsIRO2はCuの蓄積を促進し、鉄欠乏症状を部分的に回復させた。まとめると、OsbHLH156とOsIRO2 TFは、鉄のホメオスタシスだけでなく、Mn、Cu、Znの蓄積においても中心的な制御因子として機能している。
（はじめに）
鉄（Fe）、マンガン（Mn）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）のような微量栄養素は、植物の健全な成長と発育のために、わずかな濃度範囲で正確に維持されなければならない必須元素である。これらの金属の欠乏や過剰は、植物の生理学的・生化学的プロセスに深刻なダメージを与える（Alejandroら、2020；Bashirら、2021；Zahraら、2021；Kirkら、2022）。したがって、Fe、Mn、Cu、Znの感知、シグナル伝達、輸送、およびこれらの栄養素レベルを維持するメカニズム間のクロストークを正確に制御する必要がある。研究により、これらの金属は植物組織において互いのホメオスタシスに影響を及ぼすことが示されている（Rout et al.,2015） 特に、鉄の欠乏は、単子葉植物種と双子葉植物種の両方において、他の3元素の取り込みと輸送を劇的に調整する可能性がある。鉄は、Mn、Cu、Znと同じ生物学的プロセスの多くに関与している。すなわち、クロロフィル合成と光合成（Fe、Mn、Cu）、ミトコンドリア呼吸（Fe、Mn、Cu）、酸化ストレス保護（Fe、Mn、Cu、Zn）、窒素代謝（Fe、Mn、Cu）、病原体防御（Fe、Cu）、酵素補因子（Fe、Mn、Cu、Zn）などである（Hansch and Mendel, 2009; Zhao et al., 2012; Kobayashi et al., 2019）。しかし、鉄のホメオスタシスとMn、Cu、Znレベルとのクロストークの根底にある分子メカニズムは、完全には解明されていない。
鉄は土壌中に豊富に存在するが、ほとんどの鉄は不溶性の水酸化第二鉄の形で存在し、鉄の利用効率を大きく低下させるため、植物は依然として鉄欠乏のリスクにさらされている。この問題に対処するため、植物は2つの鉄獲得戦略を進化させてきた。シロイヌナズナのような非禾本植物では還元戦略（戦略I）、イネのような禾本植物ではキレート戦略（戦略II）である（Kobayashi and Nishizawa, 2012; Kobayashi et al.,2019） 戦略Iを用いる植物は、3つのステップを経て鉄を獲得する： まず、根細胞がフェノール化合物とプロトンを分泌してFeを動員し、鉄をより可溶性にする（Santi et al., 2005）。次に、酵素FRO2がFe(III)をFe(II)に還元し（Robinson et al., 1999; Connolly et al., 2003）、最後にFe(II)がIRON-REGULATED TRANSPORTER 1(IRT1)によって細胞内に輸送される（Korshunova et al., 1999; Vert et al., 2002）。戦略II植物では、ムギネ酸ファミリーフィトシデロフォア（MA）が根圏に分泌され、ムギネ酸ファミリーフィトシデロフォアのトランスポーター1（TOM1）を介してFe(III)をキレートする（Ma and Nomoto, 1993; Ma et al、 1995; Nozoye et al., 2011）、キレート体（Fe(III)-MA）はYELLOW STRIPE-LIKE トランスポーター（YSL）によって細胞内に輸送される（Curie et al., 2001; Inoue et al., 2009） 根に取り込まれた後、鉄はまず表皮細胞から維管束に輸送され、カスパリアンストリップを経由する共形成およびアポプラスティックルートを経て、導管または葉茎負荷を介して根から芽に移行する（Kobayashi and Nishizawa, 2012; Kobayashi et al.,2019） 植物体内では、可溶性Fe(II)の深刻な毒性とFe(Ⅲ)の低い溶解性のために、Fe(II)とFe(Ⅲ)の両方がキレートされなければならない。植物体内でのFe(Ⅱ)および他の遷移金属の輸送を促進するための重要な金属キレート剤のひとつがNAであり、これは3つのNA合成酵素、OsNAS1、OsNAS2およびOsNAS3によって合成される（Inoue et al.,2003） DMAはNAの構造類似体で、ニコチアナミンアミノトランスフェラーゼ（NAAT）とデオキシムギネ酸合成酵素（DMAS）によってNAから合成される。DMAはFe(III)のキレーターとしてイネの導管および葉茎から検出されている（Moriら、1991）。
鉄欠乏は、シロイヌナズナやイネにおいて、Mn、Cu、Znのような他の2価金属の蓄積を増加させる（Barberonら、2014；Caiら、2021；Chengら、2007；Longら、2010；Watersら、2012）。一方では、いくつかの万能金属トランスポーターの選択性が低いためである。AtIRT1は亜鉛、マンガン、コバルト、カドミウムなどの非鉄金属を輸送することができ（Rogersら、2000；Vertら、2002）、AtNRAMP1は鉄以外にマンガンやカドミウムも輸送することができる（Curieら、2000； Thomine et al., 2000; Cailliatte et al., 2010）。一方、多くの非鉄金属トランスポーターが鉄欠乏ストレスによって誘導されることがわかった。銅取り込み遺伝子 AtCOPT2、AtFRO4、AtFRO5 の発現は、鉄欠乏下で AtFIT（Fer-Like Iron Deficiency-Induced Transcription Factor）によって上昇した（Cai et al.,2021） AtMTP8 (Metal Tolerance Protein 8)は低鉄条件下で強く誘導され、シロイヌナズナにおける鉄栄養とMnの拮抗的干渉を防ぐのに重要な役割を果たしている(Eroglu et al., 2015)。AtMTP3は、鉄欠乏下でシュートからのZnの排出を仲介することが見出された(Arrivault et al., 2006)。AtIREG2 (Iron-regulated membrane protein 2)も鉄欠乏ストレスで誘導され、トノプラストに局在し、ニッケル、鉄、コバルトを液胞に隔離する (Schaaf et al., 2006; Morrissey et al., 2009)。
最近、塩基性らせん-ループヘリックス（bHLH）TF OsbHLH156が主要な制御因子OsIRO2と物理的に相互作用し（Ogo et al., 2006; 2007）、イネの鉄欠乏時にStrategy II遺伝子の発現を制御する核局在を促進することが見いだされた（Wang et al., 2020） 別のグループは、OsbHLH156がシロイヌナズナのFITと配列が似ていることからOsFITと命名した（Liang et al..2020） OsbHLH156/OsFITとOsIRO2のいずれかが欠損すると、イネはムギネ酸（MA）を合成できず、Fe(III)-MA複合体を介してFe(III)を取り込むことができなくなる。一方、鉄欠乏によって誘導される鉄(II)輸送体OsIRT2とOsNRAMP1はTF複合体によって制御されず、OsIRT1は部分的に制御されているに過ぎない。したがって、この変異体は、OsIRT1、OsIRT2、OsNRAMP1を通じてFe（II）を取り込むことができるため、Fe（II）を供給しても顕著なクロロシス症状を示さなかった（Wang et al.,2020） しかし、OsbHLH156とOsIRO2がMn、Cu、Znの取り込みと輸送を制御しているかどうか、またどのように制御しているかは不明である。本研究では、OsbHLH156とOsIRO2が、鉄、Mn、Cu、Znの取り込みと輸送に関連する遺伝子やNA合成遺伝子のプロモーターに直接結合し、それらの発現を活性化することで、イネにおける鉄とMn、Cu、Znとのクロストークを調節することを明らかにした。
（考察）
植物における鉄欠乏ストレスは、Mn、Cu、Znの蓄積と、これらの微量栄養素のトランスポーターをコードする遺伝子の発現レベルの両方を著しく誘導することができる。この最も一般的な説明は、IRT1やNRAMPsのようないくつかの万能金属トランスポーターが、これらの二価金属を取り込む選択性が低いことである。本研究では、鉄欠乏によって誘導される OsbHLH156-OsIRO2 TF 複合体が Mn、Cu、Zn のホメオスタシスに果たす役割を調べた。鉄欠乏下でのMn、Cu、Zn濃度の上昇は、OsbHLH156-OsIRO2 TF複合体に大きく依存していた。OsbHLH156-OsIRO2 TF複合体は、金属トランスポーター遺伝子の転写を活性化するだけでなく、Fe、Mn、Cu、Znの取り込みと輸送に重要な金属キレーターであるNAとDMAの合成も活性化する。複合体中のいずれかのTFが欠損すると、Mn、Cu、Znの蓄積が著しく減少した（図1）。
OsbHLH156-OsIRO2複合体は陸上条件下で有効である
イネは、Fe(II)取り込み機構（Strategy I-like）とFe(III)取り込み機構（Strategy II）の両方を持っている。OsbHLH156-OsIRO2複合体は、Fe(III)が主要な鉄源である陸上条件下で機能することから、Mn、Cu、Znのホメオスタシスに対するTF複合体の役割は、主に陸上条件下で生じるはずである。
一方、IRTやNRAMP型トランスポーターのような選択性の低い金属トランスポーターは、主に湛水条件下で効果を発揮するはずである。今後、湛水処理と陸上処理の両方を用いた研究により、イネにおけるFeとMn、Cu、Znのクロストークに関与するメカニズムの相対的重要性がさらに解明される可能性がある。
OsbHLH156-OsIRO2 TF複合体の直接標的トランスポーターの低選択性
微量栄養素であるMn、Cu、Znの機能は、重要な代謝に密接に関連している。これらのホメオスタシスは、蓄積による酸化傷害を避けるために、生物学的機能に最適な濃度を維持するように厳密に制御されなければならない。Strategy-I植物種であるシロイヌナズナは、FROによって還元された鉄(II)を取り込むために、主にIRTタイプとNRAMPタイプのトランスポーターを用いている。淡水条件に適応したイネは、シロイヌナズナと同様のFe(II)トランスポーターをも用いて、Fe(II)取り込み系をも有するStrategy IIの植物種の例外である。多くの研究が、金属輸送ファミリーのいくつかは非選択的であることを示している。鉄輸送体IRT1は、実はシロイヌナズナでもイネでも普遍的な金属輸送体である。OsIRT1はイネにおいて鉄、カドミウム、亜鉛を輸送することが示された。OsbHLH156-OsIRO2 TF複合体を介した鉄欠乏によるOsIRT1の誘導は、鉄欠乏下でのMn、Cu、Znの蓄積に寄与すると考えられる。さらに、OsNRAMP6とOsHMA2も非選択的金属輸送の候補であると考えられる。OsNRAMP1、3、5、6 は鉄、カドミウム、マンガンを輸送することが示され、OsNRAMP6は鉄とマンガンを輸送することが同定された。重金属ATPaseファミリーのトランスポーターOsHMA2は、Fe2+とZn2+の両方を輸送することが示された。したがって、鉄欠乏条件下では、活性型OsbHLH156-OsIRO2 TF複合体がOsNRAMP6とOsHMA2の発現を直接誘発し（図3）、鉄欠乏下でMn、Cu、Znの蓄積を増加させる可能性がある。他の直接標的であるOsCOPT1/7とOsZIP5/9/10は、それぞれ主にCuとZnを輸送し、鉄欠乏下で対応する金属含量の蓄積に寄与する。
金属元素の蓄積における金属キレーターNAとDMAの役割
鉄欠乏下で活性化したOsbHLH156-OsIRO2 TF複合体は、OsNAS1とOsNAS2の発現を誘導し、NAの蓄積を増加させた（図5Aおよび5B）。NAは、導管における鉄、銅、ニッケルの移動に重要な分子として知られており（Curie et al. シロイヌナズナとは異なり、戦略I植物であるイネは、NAを基質としてDMAを合成し、土壌中に分泌してFe(III)をキレート化することができる。DMA-Fe(III)複合体は、YSLタンパク質によって輸送され、導管や葉茎に運ばれて、Feやおそらく他の金属を長距離輸送することができる（Moriら、1991）。
銅の供給を増やすと鉄欠乏症状が緩和される
CuとFeは、多細胞生物における金属の利用可能性に応じて、多くの植物で同じ生化学反応を触媒する酵素として交互に利用される。これまでの研究で、銅関連遺伝子は鉄欠乏によって制御され、鉄欠乏下では銅を含むスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）が鉄を含むSODに代わって活性酸素種を消去する可能性が示されている。シロイヌナズナでは、鉄欠乏はFITとbHLH Ibに媒介された銅取り込み遺伝子（AtCOPT2、AtFRO4、AtFRO5）の発現を誘導し、銅の蓄積を増加させた。内因性銅濃度の増加は、Cu/ZnSOD への補酵素供給を促進し、鉄含有 SOD の減少を補うことができるため、植物の鉄欠乏ストレスに対する耐性が強化される。本研究では、osbhlh156 と osiro2 において、Cu 欠乏条件下で鉄欠乏症状が現れたが、対照条件下では現れ なかったことから（図 7B）、Cu の供給は、鉄欠乏による活性酸素種の蓄積を抑えることで葉のクロロシスを 緩和できることが示唆された。実際、銅の過剰供給は鉄欠乏をある程度補うことができた。
OsbHLH156/OsIRO2がイネのシュートにおいてMn、Cu、Znの蓄積を促進するという作業モデル。
以上のことから、イネにおけるMn、Cu、Znの輸送におけるOsbHLH156とOsIRO2の作業モデルを提案する。鉄欠乏下では、OsbHLH156とOsIRO2が強く誘導される。より高レベルのOsbHLH156 TFは、OsIRO2の核内への侵入を助け、その後OsIRO2と複合体を形成し、複数の方法でMn、Cu、Zn輸送を制御する可能性がある：(i) 他の2価金属も輸送できる鉄トランスポーターの誘導 (ii) Mn2+、Cu2+、Zn2+もキレートできるNAやDMAのような金属キレーターの誘導 (iii) Mn、Cu、Znの取り込みと移動の上流のシグナル伝達経路に影響を与える遺伝子制御（図3、4）。最終的に、鉄欠乏下ではMn、Cu、Zn濃度が上昇する。
以下図の凡例
図1. OsbHLH156とOsIRO2はMn、Cu、Znの取り込みと移動を制御する。植物は、鉄を添加または無添加の水耕栽培で生育させた。WT株、osbhlh156株、osiro2株から、10日間、鉄分充足または鉄分欠乏条件下で生育させた新芽を採取した。元素分析には、独立した3株で3回の測定を行った。Mn、Cu、Zn の濃度は ICP-MS で測定した。データは平均値±SD、n = 3; *, P < 0.05; **, P < 0.01 (Student's t-test).
図4. OsbHLH156-OsIRO2複合体は、Fe、Mn、CuおよびZnトランスポーター遺伝子の活性化に必要である。
(A）酵母ツーハイブリッドアッセイ。OsbHLH156とOsIRO2をGAL4活性化ドメイン（AD）またはGAL4 DNA結合ドメイン（BD）と融合させた。発現ベクターの異なる組み合わせを酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae AH109）に移植した。異なる酵母株を、10mMの3-AT（3-アミノ-1,2,4-トリアゾール）を添加した選択培地QDO上にプレーティングした。空ベクター(AD)と(BD)をネガティブコントロールとして用いた。
(B）転写活性化アッセイ。GUS遺伝子を標的遺伝子のネイティブプロモーターと融合させ、OsbHLH156もしくはOsIRO2、またはその両方と酵母中で共発現させた。酵母細胞を選択培地（-Trp, -Leu, -Ura）上で増殖させ、GUSバッファーを用いて染色した。青色（＋）はレポーター遺伝子GUSが転写されたことを示した。
(C) アグロバクテリウム浸潤タバコ葉におけるルシフェラーゼの発現。8つのプロモーター-ルシフェラーゼ融合体（Pgene-LUC）のそれぞれを、組換え転写因子なしで（1）、OsbHLH156（2）またはOsIRO2（3）のいずれかで、あるいはOsbHLH156とOsIRO2の両方で（4）、タバコ葉中で発現させた。OsACTIN1のプロモーターをネガティブコントロールとして用いた（最後のパネル）。(d）ルシフェラーゼ活性。相対ルシフェラーゼ活性はベクターコントロールと比較して計算した。3回の独立した実験を行った。データは平均値±SD（n = 3）を表す；**，P < 0.01(Student's t-test)。
図5. NAとDMAの生合成はOsbHLH156-OsIRO2 TF複合体によって直接制御されている。
(A）NAとDMAの合成およびDMA分泌に関与する遺伝子の発現。植物を10日間、鉄欠乏溶液または鉄供給不足溶液中で生育させた。OsACTIN1はサンプルを標準化するための内部対照として用いた。
(B）NAおよび分泌されたDMA含量。鉄欠乏下で、WT、osbhlh156およびosiro2から、根中のNA量および根から分泌されるDMA量を検出した。
(C) 転写活性化アッセイ。GUS遺伝子を4つの標的遺伝子のうちの1つのネイティブプロモーターと融合させ、OsbHLH156もしくはOsIRO2、またはその両方と酵母中で共発現させた。OsACTIN1のプロモーターはネガティブコントロールとして用いた。
(D）アグロバクテリウム浸潤タバコ葉におけるルシフェラーゼの発現。4つのプロモーター-ルシフェラーゼ融合体（Pgene-LUC）のそれぞれを、組換え転写因子なしで（1）、OsbHLH156（2）またはOsIRO2（3）のいずれかで、あるいはOsbHLH156とOsIRO2の両方で（4）、タバコ葉中で発現させた。OsACTIN1のプロモーターをネガティブコントロールとして用いた（最後のパネル）。
(E）ルシフェラーゼ活性。相対ルシフェラーゼ活性はベクターコントロールと比較して計算した。3回の独立した実験を行った。データは平均値±SD（n = 3）を表す；**，P < 0.01(Student's t-test)。
図1
図4
図5