鉄を介した小胞体ストレスによって引き起こされるオートファジーは、植物におけるPi飢餓の初期段階における重要なストレス応答である

以下は日本人研究者によるERを介した鉄とリン酸代謝研究である。まだ出版掲載されていないがアクセプトされているらしいので翻訳してみた。昔、東大の隣の有馬啓（発酵学）研究室で高月・田村(学造)らが発見した抗生物質tunicamycinがERストレスを起こすということは知らなかったのでその点でも小生にはためになった。
（概要）ばかりでなく（考察）も訳しておいた。




鉄を介した小胞体ストレスによって引き起こされるオートファジーは、植物におけるPi飢餓の初期段階における重要なストレス応答である
　　
吉武雄志、篠崎大樹、吉本幸喜 (明治大学農学部）
　　
（概要）
無機リン酸（Pi）は植物の生育に不可欠である。しかし、土壌中ではリン酸が制限されることが多い。
そのため、植物はリン酸欠乏に対応するためのいくつかの機構を確立している。
そのうちのひとつに、膜脂質のリモデリングや分解酵素によるプラスティドDNAの分解がある。
しかし、他の分解系がPiリサイクルに関与しているかどうかは、まだ不明なままである。
オートファジーは、細胞内構成要素を分解するシステムであり、窒素、炭素、亜鉛など一部の栄養素の飢餓状態での再利用に寄与している。
本研究では、オートファジー欠損変異体では、Piが早期に枯渇し、Pi飢餓下で葉の成長が著しく阻害されることを見出した。
Pi枯渇の初期段階で誘導されるオートファジーの主な荷物は、小胞体（endoplasmic reticulum）であり、ERを選択的に分解するオートファジーの一種であるER-phagyが、Piのリサイクルに寄与するためにPi飢餓の初期段階への応答に関与していることが示唆された。
このER-phagyは、小胞体ストレス応答が欠損したINOSITOL-REQUIRING ENZYME 1二重変異体ire1a ire1bで抑制されたことから、Pi飢餓初期のER-phagyは小胞体ストレスにより誘導されると推測された。
さらに、鉄を制限し、脂質-ROSの蓄積を抑制すると、ER-phagyが抑制されることがわかった。
興味深いことに、後半のPi飢餓に対する応答である膜脂質リモデリングは、ire1a ire1b の初期 Pi 枯渇条件下で加速された。
今回の研究成果により、Pi飢餓に対する応答には初期と後期の2つの段階が存在することが明らかになり、小胞体ストレスを介したER-phagyが初期段階でのPiリサイクルに関与し、後期段階の加速を抑制していることが示唆された。
　　　
　　　
（考察）
本研究では、鉄を介した小胞体ストレスによるオートファジーが、植物における重要なストレス応答であることを明らかにした。
脂質リモデリングに関わる遺伝子の発現は、転写因子であるPHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1 (PHR1) によって制御されている (Pant et al., 2015)。
Pi十分条件下では、PHR1はSIG1/Pho81/XPR1ドメイン含有タンパク質との相互作用を介したイノシトールリン酸によって不活性化される。
一方、細胞がPi飢餓状態になると、PHR1はSAP AND MIZ1 DOMAIN-CONTAINING LIGASE1（SIZ1）によってSUMO化され、その結果、活性化する。
初期のPi欠乏条件下では、PSR遺伝子の発現はColよりもatg2-1およびatg5-1で高かった（図1g）ことから、ER-phagyによってリサイクルされたPiがPHR1活性を抑制している可能性が示唆された。
さらに、ire1a ire1b 変異株では、初期のPi欠乏条件下で膜脂質のリモデリングが促進された（図4a）。
ERストレス誘導物質であるツニカマイシンによる短期間の処理は、シロイヌナズナのリン脂質代謝フラックスに影響を与えなかった。
したがって、ERストレスはおそらく、ER-phagyを受けずに脂質組成を直接変調させることはない。
以上のことから、初期Pi飢餓応答によってリサイクルされたPiは、PHR1を介したPSR遺伝子発現誘導や膜脂質リモデリングなどの後期Pi飢餓応答を抑制していることがわかった（図4e）。
また、Fer-1が初期Pi欠乏条件下でER-phagy活性を低下させたことから（図3e,f）、本研究で提案した初期Pi飢餓応答は脂質ROSを介したERストレスにより誘導されると考えられる。
一方、後期Pi飢餓応答は、細胞内Piレベルの低下によって引き起こされる。
植物が長期のPi飢餓にさらされると、ER-phagyによって供給されるPiが植物の成長に十分でなくなり、その結果、late Pi starvation応答が誘導される。
しかし、後期Pi飢餓応答は、根毛の伸長、根の構造の変化、膜脂質組成の変化などの動的変化を引き起こす。
もし、植物が初期Pi飢餓応答であるER-phagyによってPiを回収できなければ、Piが再供給されたときに迅速に正常な成長を再開することができない。
本研究は、植物のPi飢餓応答が初期と後期の2段階あることを示し（図4e）、植物が自然界の不均一なPi濃度条件に適応することを可能にするものである。
本研究では、苗をPi欠乏環境に移した後の葉のPi含量の時間変化を調べた。苗をPi欠乏条件下に移した後、葉のPi量の時間変化を調べた（図1f）。
DAT0と1では、Colとatg変異体のPi量に差はなかった。
これは、Pi飢餓の初期にはまだPiのストックがあると考えられ、自食作用の有無に関わらずPi量に差は見られなかった。
DAT4後では、Colとatg変異体の間でPi量に差はなかった。
小胞体ファジーによって再利用されるPiは、このような遅いPi欠乏状態では十分でないと考えられる。
しかし、DAT2および3では、atg2-1およびatg5-1では、ColよりもPi量が少なく、この時点では、オートファジーがPiリサイクルに重要であるという結論が支持された。
一方、以前の報告では、Pi欠乏状態の根の分裂組織におけるオートファジーは、Piリサイクルのレスキュー戦略ではない可能性が高いことが示唆された。
このオートファジーは、根端分裂組織（RAM）と根移行／早期伸長領域で細胞型特異的なPHOSPHATE DEFICIENCY RESPONSE 2-LOW PHOSPHATE RESPONSE1モジュールを必要とした。
本研究で観察されたオートファジーのプロセスと表現型は、分裂期領域ではなく、十分に拡大した古い細胞で観察された。したがって、Pi飢餓下の葉におけるオートファジーの狙いは、根におけるそれとは異なる可能性がある。
この目的の詳細を明らかにするためには、さらなる解析が必要である。
鉄の制限は、後期Pi飢餓下でPi含量を増加させる。しかし、初期のPi欠乏条件下では、Fe制限によってPi量が減少した（図3a）。
Fe制限によりER-phagyが抑制され、細胞内へのPi放出が抑制されると考えられるため、植物はPi飢餓の初期段階でも厳しいPi飢餓に曝されることになる。実際、-Pi-Fe条件下では、DAT2において、-Pi条件よりもPi量が少なく、PSR遺伝子の発現が高かった（図3a）。
このような状況が長く続くと、PHR1を介したPi取り込みの促進などのPi飢餓後期応答が増強されると考えられる。
このように、低Pi培地（0.1mM Pi）でのFe制限により、Pi含量が後期にアップレギュレートされる可能性がある。
植物では、オートファジーが活性酸素の蓄積を抑制する。したがって、オートファジー欠損変異体は、野生型よりも高いレベルで活性酸素を蓄積する。さらに、活性酸素はプログラムされた細胞死を誘導する。
我々の実験では、atg2-1およびatg5-1は、初期のPi欠乏条件では後期のPi飢餓応答が増強されたにもかかわらず、Pi欠乏条件下で重度の成長障害を示した（図1b-d）（図1g）。これは、活性酸素の蓄積に起因すると考えられる。
動物細胞では、過剰な鉄は「フェロプトーシス」と呼ばれる非アポトーシス性の細胞死を誘導する。 この現象では、フェントン反応により、細胞内でFe2+と共にLipid-ROSが生成される。 Lipid-ROSは、ERストレスだけでなく、細胞死も誘導する。
Fe 制限が Pi 枯渇条件下で生じる成長障害を緩和するもう一つの可能性は、Fe 制限が細胞外膜の主成分である PC および PE の細胞外 ROS およびヒドロキシ脂肪酸の蓄積を抑制するとの観察から説明できた。
ire1a ire1b 変異株の膜脂質の比率は、後半の Pi 枯渇条件下で Col と同様であったが、TAG 含有量は Col よりも ire1a ire1b 変異株で高かった（図 4b、d）。Pi飢餓はTAGの蓄積を誘導し、葉に脂質滴を形成する。
クラミドモナス・レインハルディにおける先行研究では、ERストレス過敏性変異体では、脂質滴の形成が野生型よりも促進されることが示されている。また、ROSストレスは脂質滴形成を促進する。
本研究の結果、Pi飢餓は葉の細胞にERストレスとROSの蓄積を誘導することが明らかになった。
したがって、Pi飢餓下では、細胞内のPi量の減少ではなく、Pi飢餓に起因するERストレスやROS蓄積によってTAGの蓄積が促進される可能性がある。今後、小胞体ストレスと脂質代謝の関係をさらに詳しく調べることで、Pi飢餓下でのTAG蓄積のメカニズムが明らかになると考えられる。
栄養飢餓ストレスが非選択的オートファジーを誘導することはよく知られている。
しかし、Pi飢餓によるER-phagyは、ERストレス応答に関わる因子を利用しているようである（図2d,e）。
さらに、過剰な硝酸塩は、Pi飢餓下でRCBを介したクロロファジーを誘導する。
さらなる確認が必要であるが、Pi飢餓によって誘導されるオートファジー過程は、非選択的ではなく、選択的であるように思われる。この選択性を担うアダプタータンパク質の単離は、Pi飢餓に対する反応全体を完全に理解するために不可欠である。
我々は、鉄を介した活性酸素の蓄積が小胞体ストレスを誘導することを示した（図3b）。
小胞体ストレスは、熱ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレスによって誘導される。これらのストレスはすべて植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA）に関連している。
bZIP17とS2Pの活性化は、ABAシグナルのネガティブレギュレーターをコードする遺伝子をアップレギュレートする。
しかし、ERストレスに対するABAの効果を調べた研究はほとんどない。
最近の研究では、外因性ABAが活性酸素の蓄積を誘導することが示された。
一方、ABAはオートファジー活性を阻害し、オートファジーの欠損は活性酸素の蓄積を誘導する。今後、ABAシグナルやオートファジー欠損変異体を用いた解析により、環境ストレスが小胞体ストレス反応に与える影響を明らかにすることが期待される。
　　
　　
　　
　　
　　
（以下図１，２，３，４の説明）
　　　
図1. オートファジーは、Pi欠乏条件下での植物の成長に寄与する。
(a)　処理方法図。10日齢の苗をPi不足の培地に播種し、Pi不足または-不足の培地に様々な期間移し替えた。植物は、移植後0、1、2、3、4、6および8日目に収穫された（それぞれDAT0、DAT1、DAT2、DAT3、DAT4、DAT6およびDAT8）。
(b)　DAT8植物の成長表現型。矢印はクロロティックな葉を示す。スケールバー＝1cm。
(c,d)　 DAT8植物のシュート新鮮重(c)とクロロフィル量(d)の-Pi/+Pi比の値。
(e,f)　 Pi-sufficient (e) および -depleted (f) 条件下での第一葉および第二葉のPi含量。(g)　DAT2植物の第1葉および第2葉におけるAt4遺伝子の発現。
植物は、Pi充足（+Pi；白棒）または　-不足（-Pi；灰棒）条件下で栽培された。データは3連の平均±SDを表す。*, p < 0.05; ***, p < 0.005 各条件下でのダネット検定値 vs. Col。FW、新鮮重。
　　
図2. 初期Pi飢餓は、ERストレスを介したER-phagyを誘導する。
(a) 1葉および2葉の生細胞におけるER targeted GFP融合タンパク質のLSCM可視化。葉はConcAと20時間インキュベートされた。
(b) 視野内（354.2μm×354.2μm）に存在するERを含むABの個数。
(c) DAT2 Col植物の第1葉および第2葉におけるERストレス応答遺伝子BiP3の発現。
(d) Pi十分条件とPi欠乏条件下での第一葉および第二葉の生細胞における ER 標的 GFP 融合タンパク質の LSCM による可視化。葉はConcAと20時間インキュベートした。
(e) 視野内（354.2μm×354.2μm）に存在するERを含むABの個数。
(f) DAT2植物の第1葉および第2葉におけるPi含有量。
植物はPi充足（+Pi；白バー）またはPi欠乏（-Pi；グレーバー）条件下で生育させた。矢印はERを含むABを示す。スケールバー＝10μm。GFP蛍光（緑）およびクロロフィルa自発蛍光（マゼンタ）を示す。
データは3回（c,f）または9回（b,e）の連数の平均±SDを表す。
異なる文字はTukey's test (b)のp < 0.05で有意差を示す。各条件下での+Pi (c) またはCol (e,f) に対するStudent's t-test 値は、*, p < 0.05; **, p < 0.01 を示す。
　　　
図3. 鉄を介した脂質-ROS蓄積はER-phagyを誘導する。
(a) DAT2植物の第1葉および第2葉におけるPi含量。
(b) DAT2植物の第1葉および第2葉におけるBiP3の発現。
(c)　第1葉および第2葉の生細胞におけるER標的GFP融合タンパク質のLSCMによる可視化。葉はConcAと20時間インキュベートされた。
(d) 各条件下で視野（354.2μm×354.2μm）内にあるERを含むABの数。
(e) 　Pi-十分またはPi欠乏条件下での1葉および2葉の生きた葉細胞におけるER標的GFP融合タンパク質のLSCMによる可視化。葉はConcAとFer-1（+Fer-1）またはFer-1なし（-Fer-1）と共に20時間インキュベートした。
(f) 視野内（354.2μm×354.2μm）のERを含むABの数。矢印はERを含むAbsを示す。スケールバー＝10μm。GFP蛍光（緑）およびクロロフィルa自家蛍光（マゼンタ）を示す。データは3回（a,b）または9回（d,f）の生物学的複製の平均±SDを表す。異なる文字はTukey's testのp < 0.05で有意差を示す(a,b,d)。***, p < 0.005, 各条件下でのスチューデントのt-検定値対-Fer-1 (f).
　　　　
図4. ER-phagyは膜脂質のリモデリングを抑制する。
(a,b)　膜脂質組成の-Pi/+Pi比の値。DAT3 (a) と DAT8 (b) における Col (White bar) と ire1a ire1b (Gray bar) のシュートでの膜脂質組成の -Pi/+Pi 比の値。
(c,d)　 DAT3(c)およびDAT8(d)におけるシュートのTAG含量。植物はPiが十分な条件下（+Pi；白棒）または欠乏な条件下（-Pi；灰棒）で栽培された。
(e)　初期Pi飢餓に対する応答の機構モデル。Pi飢餓下では、細胞内に過剰なFeが流れ込み、ER膜脂質が酸化される。脂質ROSの蓄積により、ER-phagyが誘導される。ER-phagyによって生成されたPiは細胞内に放出され、Pi飢餓応答の遅延を抑制する。データは9つの生物学的複製の平均値±SDを表す。各条件下でのColに対するStudent's t-testの値は、*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.005 である。MGDG, モノガラクトシルジアシルグリセロール；DGDG, ジガラクトシルジアシルグリセロール；PE, ホスファチジルエタノールアミン；PI, ホスファチジルイノシトール。

図1、図2

図3

図4