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-植物鉄栄養研究会-


NPO法人
19生都営法特第463号
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2つのNPF(NRT1/PTR family)トランスポーターはシロイヌナズナにおける鉄の長距離輸送とホメオスタシスを媒介する

Date: 2021-12-28 (Tue)

2つのNPFトランスポーターはシロイヌナズナにおける鉄の長距離輸送とホメオスタシスを媒介する。

Two NPF transporters mediate iron long-distance
transport and homeostasis in Arabidopsis
Si-Ying Chen, Tian-Yu Gu, Zi-Ai Qi, Jing Yan, Zi-Jun Fang, Yu-Ting Lu, Hui Li and Ji-Ming Gong
*Correspondence: Ji-Ming Gong (jmgong@cemps.ac.cn)
https://doi.org/10.1016/j.xplc.2021.100244

Plant Comm. 2, 100244.

(要約)
植物の鉄のホメオスタシスには鉄の輸送と再配置が不可欠であるが、特にストレス下でどのように鉄が輸送されるかは不明である。
  
我々は、NPF5.9とその近縁種のNPF5.8 のホモログは、シロイヌナズナにおける鉄の輸送と再配置を重複して制御していることを報告する。
NPF5.9は鉄欠乏に反応して高くアップレギュレートされる。
NPF5.9 は通導組織で優先的に発現し、トランスゴルジネットワークに局在しており、 NPF5.8 も同様の発現パターンを示していた。
NPF5.9 を過剰発現させた系統では、地上部への鉄の長距離輸送と分配が有意に増加した。また
二重変異体 npf5.8 npf5.9 では、地上部での鉄の蓄積と植物の成長が減少したが、これは鉄の補給により部分的に回復した。
さらに分析したところ、PYE の発現が、鉄の供給によって部分的に回復することがわかった。
鉄のホメオスタシスの負の制御因子とその下流標的である NAS4 は、この二重変異体で有意に変化した。NPF5.9 と NPF5.8 は、硝酸塩の取り込みと輸送も媒介することが示された。硝酸と鉄の投与が相互に影響しあうことはないにもかかわらず。
今回の成果によりNPF5.9とNPF5.8は、鉄の長距離鉄輸送とホメオスタシスに関与しており、さらに、シロイヌナズナでは、硝酸塩の輸送と鉄のホメオスタシスをそれぞれ独立して媒介することが明らかになった。
 
 
以下図の説明。紙面の都合上、訳文は図1−7まで訳しているが、図は図1,2,3のみを示している。
  
図1. 鉄欠乏時の NPF5.9 発現。
(A) qRT-PCR による鉄欠乏時の苗木の地上部および根における NPF5.9 の発現の測定。5 日齢の播種苗を培地に移しFeあり(+)またはFeなし(―)で3日間栽培した後、サンプリングした。
(B) 根、茎、葉、花および長角果における NPF5.9 の発現の qRT-PCR 解析。水耕栽培した4週齢のCol-0植物から組織を採取した。qRT-PCR データは Actin2 に対して正規化した。
(C) NPF5.9 pro:GUS トランスジェニック植物の苗を 2 mM Fe で 24 時間処理(mock)または無処理(_Fe)した場合の GUS 染色。
(D-H) NPF5.9 pro:GUS トランスジェニック植物幼植物 (D)、根の内鞘細胞 (E)、葉 (F)、花 (G) および葯 (H) における GUS 染色。数値は
平均±SD、n = (A)では6、(C)では3。
棒グラフは、(D), (F), (G)では1 mm、(H)では0.1 mm、(E)では10 mmである。
 
 
図2. NPF5.9のトランスゴルジネットワークにおける細胞内局在。(A) 35S:NPF5.9-GFPを保有するトランスジェニック植物の4日目の苗の根の表皮細胞における蛍光性。(B) NPF5.9pro:NPF5.9-GFPを保有する7日齢のトランスジェニック系統の根の維管束における蛍光。epは表皮;coは皮質;enは内皮を表す。緑色または赤色の蛍光はGFPまたはヨウ化プロピジウム(PI)チャンネルを表す。棒グラフは(A,B)の5mm。(C) シロイヌナズナプロトプラストにおけるNPF5.9-eYFP融合タンパク質とトランスゴルジネットワーク局在マーカーAtSYP61-mRFPとの共局在化。棒グラフ、10mm。
 
図3. NPF5.9 を過剰発現させた植物の地上部における鉄過剰供給。(A) NPF5.9 の過剰発現株 OE5.9 と野生型を通常の 1 /2 MS 培地 (1 /2 MS) または 500 mM Fe-EDTA (103Fe) で 30 日間栽培した。(B) 水耕栽培した 3 週齢の植物を、Fe 含有量測定のためのサンプリング前に 1 週間、表示通りの処理をした。対照は、通常の鉄を用いた状態を表す。(C) 3 週齢の土壌栽培の過剰発現株は、野生型と比較して葉のクロロシスが見られる。バー、1cm。(D) 5 週齢の土壌栽培植物から組織を採取し、ICP-MS により茎、ロゼット葉、尾状葉、花、長角果および木部樹液中の鉄濃度を検出した。数値は平均±SD,n = 4。アスタリスクはスチューデントのt検定による*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001での差を示す。バー、(AおよびD)の1cm。
 
図4. npf5.8 npf5.9 二重変異体における葉のクロロシスと植物の生育の変化。(A and B) Col-0 および npf5.8 npf5.9 二重変異体 (dm-2, dm-3) を 0.5 mM Fe-EDDHA を含む (Fe) または含まない (control) 土壌で栽培し、3 週齢の葉のクロロシス (A) または 4 週齢の植物の成長 (B) を画像で確認し た。白棒は(A)では1 cm、(B)では10 cm、黒棒は5 mm。(A)において、左側の赤枠は右側に拡大表示された葉の輪郭を示す。黒い矢じりは葉のクロロシスを示す。(C) 4週齢のCol-0とnpf5.8 npf5.9二重変異体の0.5 mM Fe-EDDHAで加水した子実体の代表的な画像。バー:1 cm。(D) Col-0 と npf5.8 npf5.9 二重変異体の胞子数(C)より。数値は平均値±SD、n = 7。異なる文字は二元配置分散分析によるP < 0.05で有意差を示す。
 
図5. npf5.8 npf5.9 における鉄蓄積量の減少と、鉄供給による葉面鉄の回復。(A) 土壌で栽培した 4 週齢の植物から木部樹液を採取し、Fe 含有量を測定した。(B) 水耕栽培で育てた2週齢の植物の根のFe含有量。(C) 土壌栽培した植物に水(対照)または 0.5 mM FeEDDHA(Fe)を4週齢まで灌漑し、ロゼット葉、花、または珪藻でFe含有量を分析した。数値は平均値±SD、n = 4。(A and B)のアスタリスクは,Student's t-test により Col0 と比較して **P < 0.01 または ***P < 0.001 であることを示す。(C)の棒グラフの上の異なる文字は、二元配置分散分析によるP < 0.05の有意差を示す。
0.05 by two-way ANOVA.
 
 
図6. npf5.8 npf5.9 二重変異体における遺伝子発現の変化。14 日齢の野生型および二重変異体を、通常の鉄(コントロール)または鉄飢餓(Fe) を含む水耕栽培溶液に 72 時間かけて移し、サンプリングして RNA を抽出した。鉄取り込み制御因子 FIT とその下流遺伝子 IRT1 および FRO2、鉄輸送・隔離遺伝子 NAS4、FRO3 および ZIF1 とその負の制御因子 PYE、鉄欠乏反応の負の制御因子 BTS、硝酸トランスセプター NRT1.1 についてリアルタイム RT-PCR により相対発現量を測定した。数値は平均値±SD、n = 4。アスタリスクは、Col-0と比較して*P < 0.05, **P < 0.01, または ***P < 0.001で差があることを示す。
 
 
図7. NPF5.9とNPF5.8は硝酸塩輸送を媒介する。(A) H2O(上)またはNPF5.9 cRNA(下)を注入した単一卵子において、pH5.5、保持電位60mVで10mM NO3により誘発される代表的な内向き電流を記録した。(B) NPF5.8とNPF5.9の高親和性または低親和性硝酸塩取り込み活性。H2O、NPF5.8 cRNA、または NPF5.9 cRNA を注入した卵母細胞を 0.25 mM 15NO3 at pH 5.5/pH 7.4 または 10 mM 15NO3 at pH 5.5/pH 7.4 とともに3時間インキュベーションした。アスタリスクは差を示す(*P < 0.05 Student's t-test)。(C) 土壌で栽培した4週齢の植物の木部樹液およびロゼット葉における硝酸塩の定量。(D E) 水耕栽培した 3 週齢の植物に 3 日間の鉄欠乏を行い、ロゼット葉(D)および根(E)中の硝酸塩量を高速液体クロマトグラフィーで 分析した。数値は平均値±SD、n = 4。アスタリスクは、スチューデントの t 検定により、野生型 Col-0 と比較して二重変異体では *P < 0.05, **P < 0.01, または ***P < 0.001 で差があることを示している。
 

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図1

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図2

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図3